Как применять стафилококковый бактериофаг: Бактериофаг стафилококковый: применение при золотистом стафилококке, лечение антистафилококовым бактериофагом, инструкция, противопоказания и состав

Бактериофаг стафилококковый :: Инструкция :: Цена :: Описание препарата

Бактериофаг стафилококковый (Bacteriophagum Staphylococcum)
Раствор Бактериофаг стафилококковый содержит:
Стерильный очищенный фильтрат фаголизатов бактерий Staphylococcus;
Консервант – хинозол.
Бактериофаг стафилококковый – лекарственный препарат, обладающий специфическим бактерицидным действием в отношении штаммов стафилококков, наиболее значимых в этиологии гнойных и воспалительных заболеваний.
Бактериофаг стафилококковый специфически лизирует бактерии Staphylococcus. Фаговые частицы прикрепляются к мембране чувствительных бактерий, проникают внутрь клетки и размножаются за счет её ресурсов. Вследствие этого происходит гибель клетки и выход зрелых фаговых частиц, способных к заражению других чувствительных бактериальных клеток.
Бактериофаг стафилококковый не влияет на другие бактерии, в частности не нарушает естественную микрофлору.
Бактериофаг стафилококковый применяют для лечения заболеваний различной локализации, которые обусловлены стафилококками.
В ЛОР-практике и пульмонологии Бактериофаг стафилококковый применяют для лечения пациентов с отитом, синуситом, ларингитом, трахеитом, фарингитом, гайморитом, ангиной, плевритом, бронхитом и пневмонией.
В хирургической практике препарат используют для лечения пациентов с инфицированными ранами, ожогами, флегмоной, фурункулами и карбункулами, а также гидраденитом, маститом, остеомиелитом, бурситом и парапроктитом.

Кроме того, Бактериофаг стафилококковый используют в лечении генерализованных септических заболеваний, а также урогенитальных и энтеральных инфекций, включая уретрит, пиелонефрит, цистит, кольпит, сальпингоофорит, эндометрит, дисбактериоз, гастроэнтероколит и холецистит.
В педиатрической практике Бактериофаг стафилококковый назначают новорожденным при пиодермии, гастроэнтероколите, сепсисе, омфалите и конъюнктивите.
Рекомендуется профилактическая обработка послеоперационных и свежеинфицированных ран препаратом Бактериофаг стафилококковый.


Бактериофаг стафилококковый предназначен для местного, ректального и перорального применения. Перед применением следует встряхнуть флакон, при наличии видимого осадка или изменении прозрачности раствор применять нельзя.
Для достижения максимального терапевтического эффекта лечение следует начинать как можно раньше после появления симптомов заболевания.
Продолжительность терапии, схему применения препарата и дозы определяет врач.

Местно препарат применяют в зависимости от локализации инфекции:
1) В гинекологической практике препарат применяют в форме орошений, аппликаций и тампонов, смоченных раствором;
2) В хирургической практике раствор используют в виде промываний, орошений, тампонирования, а также для введения в дренированные или ограниченные полости;
3) Введение в суставную, плевральную и прочие ограниченные полости, в том числе дренированную полость мочевого пузыря и почечной лоханки, через капиллярный дренаж, нефростому или цистостому;

4) В отоларингологической практике раствор используют для промываний, орошений, смачивания стерильных турунд, а также в качестве назальных и ушных капель;
5) При кишечных заболеваниях назначают ректальное введение бактериофага (в комплексе с приемом внутрь).

Рекомендованные разовые дозы для пациентов различных возрастных групп:
Детям младше 6 месяцев ректально, как правило, назначают 10 мл бактериофага, перорально – 5 мл препарата. Первые дозы препарата следует вводить в виде высоких клизм, если не отмечается развития срыгиваний, нарушений пищеварения и прочих нежелательных эффектов бактериофаг можно назначать перорально или перорально и ректально.
Детям 6-12 месяцев ректально, как правило, назначают 20 мл бактериофага, перорально – 10 мл препарата;
Детям 1-3 лет ректально, как правило, назначают 30 мл бактериофага, перорально – 15 мл препарата;
Детям 3-8 лет ректально, как правило, назначают 40 мл бактериофага, перорально – 20 мл препарата;
Взрослым и детям старше 8 лет рекомендуется назначение 30 мл раствора Бактериофаг стафилококковый перорально и 50 мл препарата при ректальном применении.

Средняя продолжительность терапии составляет от 7 до 20 дней. При рецидивирующих формах заболеваний можно назначать несколько курсов препарата Бактериофаг стафилококковый в год.
Следует учитывать, что если перед местным применением препарата Бактериофаг стафилококковый проводилась обработка химическими антисептиками, то до использования бактериофага следует промыть участок кожного покрова изотоническим раствором натрия хлорида.


При применении раствора Бактериофаг стафилококковый не было отмечено развития нежелательных эффектов.
Нет противопоказаний к применению раствора Бактериофаг стафилококковый.
Бактериофаг стафилококковый в период беременности и кормления ребенка грудью может применяться под контролем врача.
Бактериофаг стафилококковый допускается применять сочетано с антибактериальными препаратами, а также лекарственными средствами других групп.
Не поступало сообщений о передозировке препарата Бактериофаг стафилококковый.
Раствор Бактериофаг стафилококковый по 20 или 100 мл во флаконах, в пачку из картона вкладывают 4 флакона по 20 мл или 1 флакон, содержащий 100 мл раствора.
Бактериофаг стафилококковый следует хранить в помещениях с температурным режимом от 2 до 8 градусов Цельсия.
Бактериофаг стафилококковый годен в течение 2 лет после выпуска.
Препарат Бактериофаг стафилококковый можно транспортировать при температурном режиме от 8 до 30 градусов Цельсия в течение не более 30 дней.

Стафилококковое пищевое отравление (A05.0)

Диарея и гастроэнтерит предположительно инфекционного происхождения (A09)

Стафилококковая инфекция неуточненная (A49.0)

Септицемия, вызванная Staphylococcus aureus (A41.0)

Септицемия, вызванная другим уточненным стафилококком (A41.1)

Септицемия, вызванная неуточненным стафилококком (A41.2)

Стрептококки и стафилококки как причина болезней, классифицированных в других рубриках (B95)

Остеомиелит неуточненный (M86.9)

Стафилококковый артрит и полиартрит (M00.0)

Дисбактериоз (K63.8.0*)

фаголизат бактерий Staphylococcus

Страна-производитель – Россия.

Инструкция составлена коллективом авторов и редакторов сайта Piluli. Список авторов справочника лекарств представлен на странице редакции сайта: Редакция сайта.

Ссылки на использованные источники информации.


Описание препарата “Бактериофаг стафилококковый” на данной странице является упрощённой и дополненной версией официальной инструкции по применению. Перед приобретением или использованием препарата вы должны проконсультироваться с врачом и ознакомиться с утверждённой производителем аннотацией.
Информация о препарате предоставлена исключительно с ознакомительной целью и не должна быть использована как руководство к самолечению. Только врач может принять решение о назначении препарата, а также определить дозы и способы его применения.

Количество просмотров: 276982.

что это такое, их применение

До сравнительно недавнего времени бактерии и вирусы считались исключительно «врагами» для человека. Однако научные открытия доказывают, что даже представителям микромира можно найти полезное применение. Каким образом? Об одном из таких примеров – наша статья.

Середина прошлого века была ознаменована серьёзным открытием в медицине: появились первые антибиотики и зазвучали оптимистичные прогнозы о скорой и окончательной победе человечества над большинством инфекций. Однако на тот период эта мечта оказалась несбыточной, поскольку медики столкнулись с неприятным сюрпризом: мутации и изменение морфологических и функциональных свойств позволили бактериям приобрести устойчивость (резистентность) к самым мощным антибиотикам.

Со временем проблема медленно, но неуклонно усугублялась. В современном мире существует реальная угроза развития таких микроорганизмов, которые будут обладать высокой резистентностью ко всем разработанным на сегодняшний день антибактериальным препаратам. Вот тут на помощь, по мнению учёных, и могут прийти бактериофаги – «пожиратели бактерий», которые мутируют с той же скоростью, что и бактерии.

Кто открыл бактериофаги?

У бактерий, как и у других живых существ, есть естественные враги – вирусы, которые стоят «на страже» эволюционного баланса, отслеживают состояние бактерий, и при их активном размножении начинают так же быстро увеличиваться в количестве.

Первые сведения о бактерицидном действии неизвестной субстанции появились в конце 19 века, когда британский бактериолог Эрнест Ханкин заметил, что люди, купающиеся в «святых водах» Ганга и Джамны (Индия) чудесным образом исцеляются от холеры. Спустя десятилетия в 1915 году его соотечественник Фредерик Творт обнаружил вирусы, уничтожающие бактерии. Через два года после него французский учёный Феликс д’Эрель сообщил, что открыл «невидимый микроб», поражающий дизентерийную палочку. Им же впервые был применён термин «бактериофаг» («поедатель бактерий»), которым мы пользуемся по сей день.

В это же время вдали от Франции, в Трапезунде (Турция), грузинский врач Георгий Элиава обнаружил бактерицидное действие воды в реке Кура и, благодаря публикации д’ Эреля, сделал вывод, что причина этого явления – бактериофаг. В 1920 году он открыл в Тбилиси научно-исследовательский институт, специалисты которого приступили к изучению фагов с целью их терапевтического применения. История применения бактериофагов в медицине на протяжении полувека была бы более богатой, если бы не стремительное распространение антибиотиков на Западе, которое привело в середине прошлого века к потере интереса к фагам у большинства фармацевтических компаний.

Однако грузинский НИИ бактериофагов не прекратил свою деятельность и превратился в единственный в мире центр для исследования фагов. В последние десятилетия интерес к теме бактериофагов разгорелся вновь, что, вероятно, можно объяснить развитием лекарственной устойчивости у бактерий к большинству антибиотиков.

Механизм действия бактериофагов

У каждой бактерии есть определённый вирус-фаг, который способен её разрушить. Посредством жгутиков фаги протыкают стенку бактерии и, сокращаясь, впрыскивают свой генетический материал внутрь клетки. С этого момента начинается инфекционный цикл: вначале переключаются механизмы жизнедеятельности бактерии на обслуживание бактериофага, размножается его геном, развивается ДНК вируса. В итоге бактериальная клетка разрушается и множество фагов устремляется наружу.

Бактериофаги отличаются специфичностью: поражая определённую бактерию, для всех остальных микроорганизмов они безвредны.

Лечение бактериофагами

Благодаря уникальным свойствам избирательного уничтожения болезнетворных бактерий, фаги стали применять для лечения и профилактики некоторых инфекционных заболеваний.

Против каких болезней врачи используют бактериофаги сегодня?

Наиболее широко применяется стафилококковый, стрептококковый, холерный бактериофаги, эффективные в терапии как острых, так и хронических форм заболевания, а также бактерионосительства. Кроме того, существуют фаги для лечения брюшного тифа, дизентерии, сальмонеллезов. Бактериофаги оказываются единственным эффективным средством в тех случаях, когда вышеуказанные инфекции вызываются не традиционными, а устойчивыми к антибиотикам штаммами.

Использование бактериофагов не ограничивается лишь медицинской сферой. К примеру, с 2007 года в Соединённых Штатах после серии исследований фаги были признаны безвредной добавкой и стали использоваться в качестве консерванта при производстве сыров и других скоропортящихся продуктов.

Открытые вопросы

Бактериофаги не всесильны: как оказалось, бактерии могут быть устойчивы не только к антибиотикам, но и к фагам. В связи с этим применяются методы определения чувствительности бактерий, полученных от пациента, к имеющимся в арсенале доктора бактериофагам.

Другой изучаемой сегодня проблемой является роль бактериофагов в приобретении бактериями генов устойчивости к антибиотикам.

В качестве заключения

Для оценки преимуществ и широких возможностей фаготерапии, несправедливо отвергнутой в определённую эпоху большинством исследователей, потребовалось достаточно много времени. Однако забытый метод переживает в настоящее время второе рождение и имеет все шансы стать эффективным оружием в борьбе человека с миром болезнетворных микроорганизмов. Это позволит фаготерапии развиваться и завоёвывать новые горизонты в современной медицине.

Бактериофаги

БАКТЕРИОФАГИ КАК АЛЬТЕРНАТИВА АНТИБИОТИКАМ В ЛЕЧЕНИИ ИНФЕКЦИЙ

Бактериофаги — вирусы бактерий, естественные микроорганизмы, которые, размножаясь внутри бактериальной клетки, ведут к ее быстрой гибели.

Из истории открытия

В 1896 году английский бактериолог Э. Ханкин, исследуя антибактериальное действие воды индийских рек, пришел к выводу о существовании агента, проходящего через бактериальные фильтры и вызывающего лизис холерных вибрионов. Российский микробиолог Н. Ф. Гамалея в 1897 году наблюдал лизис бацилл сибирской язвы. Однако первой научной публикацией о фагах стала статья английского микробиолога Ф. Туорта, в которой он в 1915 году описал инфекционное поражение стафилококков, значительно изменявшее морфологию колоний. В 1917 году канадский бактериолог Ф. Д’Эрелль независимо от Туорта сообщил об открытии вируса, «пожирающего» бактерии — бактериофага.

Интересный факт: при нанесении бактериофага на влажные слизистые он за 20 минут очищает их от определенного вида бактерий, например от стафилококка. Так быстро не работает ни один антибиотик.

Действие бактериофагов отличается от действия антибиотиков:

  1. Для определенного вида бактерий существует свой определенный бактериофаг. Но стоит отметить, что не ко всем бактериям есть бактериофаги (это основной недостаток этих препаратов). Для решения вопроса, какую терапию выбрать для лечения инфекции, врач должен сначала взять материал для посева на флору с точным определением вида возбудителя и только после получения анализа на чувствительность микроорганизма к бактериофагам выбрать препарат.
  2. Бактериофаги не действуют на нормофлору (нормальные бактерии), поэтому лечение бактериофагами экологично и не требует коррекции нормофлоры.
  3. Бактериофаги не влияют на организм человека, поскольку не способны проникнуть в клетки человека. Поэтому бактериофаги не токсичны и не вызывают побочных эффектов.
  4. После уничтожения патогена элиминируются (самовыводятся) из организма.
  5. Бактериофаги просты в применении: большинство их производится в жидком виде. Доступно наружное орошение при местном применении, полоскании, в виде микроклизм при кишечных инфекциях. Но действуют бактериофаги только местно, то есть именно там, где вы их применяете при полоскании, орошении и закапывании. В отличие от антибиотиков, которые при приеме внутрь распределяются по организму и действуют во всех органах и тканях.
  6. Бактериофаги стимулируют местный иммунитет, так как частицы уничтоженных бактерий побуждают иммунную систему к выработке специфических антител. Из-за этого свойства бактериофаги являются препаратом выбора в лечении бактерионосительства (например, стафилококконосительства) и хронических форм бактериальных инфекций.
  7. Сочетаются с другими препаратами, в том числе с антибиотиками. Их совместное применение ведет к быстрому выздоровлению от бактериальной инфекции.
  8. По совокупности описанных свойств бактериофаги применимы как основной препарат для лечения бактериальных инфекций у беременных, детей с рождения и людей пожилого возраста, а также в тех случаях, когда имеется полирезистентность микроорганизма к антибиотикам.

В лаборатории KDL предлагается 2 варианта посевов на флору с определением чувствительности выделенной культуры микроорганизма к препаратам бактериофагов и разным наборам антибиотиков в зависимости от ситуации пациента (выбирает врач), например:

Посев на микрофлору отделяемого урогенитального тракта женщины с определением чувствительности к основному спектру антибиотиков и бактериофагам, в т.ч. Кандида

Посев на микрофлору отделяемого урогенитального тракта женщины с определением чувствительности к расширенному спектру антибиотиков и бактериофагам, в т.ч. Кандида

Какие инфекции можно лечить бактериофагами:

  • кожные, ожоговые и раневые инфекции;
  • инфекции ЛОР органов;
  • инфекции урогенитального тракта;
  • отдельные инфекции желудочно-кишечного тракта.

Возбудителями этих инфекций могут быть такие бактерии, как золотистый стафилококк, синегнойная палочка, патогенные формы кишечной палочки, сальмонеллы, стрептококки.

В Новосибирском научном центре технологии персонализированного лечения бактериофагами в большой коллекции бактериофагов есть уникальные штаммы, способные бороться с недавно появившимися и уже получившими широкое распространение возбудителями больничных инфекций, такими как грамотрицательные бактерии Acinetobacter baumanii, Stenotrophomonas maltophilia и др.

Последние годы ознаменовались широкими исследованиями бактериофагов из-за нарастающей проблемы  антибиотикорезистентности микроорганизмов, которые находят всё новые применения не только в терапии и профилактике, но и в биотехнологиях. Их очевидным практическим результатом должно стать возникновение нового мощного направления персонализированной медицины, а также создание целого спектра технологий в пищевой промышленности, ветеринарии, сельском хозяйстве и в производстве современных материалов. Мы ждем, что второе столетие исследований бактериофагов принесет не меньше открытий, чем первое.

Поделиться статьей:

Остались вопросы?

Что лучше: антибиотики или бактериофаги

Людмила Игнатьева

26 июля 2019 в 09:00 Здоровье 10541 5 минут

Статья

А вы боитесь давать ребёнку антибиотики? Как они действуют и что лечат? Какая альтернатива есть в современной медицине? Разбираемся в авторской колонке педиатра Людмилы Игнатьевой.

Чем лечить бактериальную инфекцию у детей? По этому вопросу у врачей есть разные мнения, поэтому его широко обсуждают и мамы, которым часто предстоит делать непростой выбор. Поговорим про антибиотики и бактериофаги, их плюсы и минусы. 

Самая актуальная и полезная информация для современных родителей – в нашей рассылке.
С нами уже более 30 000 подписчиков!

Спасибо сэру Александру Флемингу за поистине величайшее открытие: первый из известных антибиотиков – пенициллин – был открыт им в 1920-е годы. Массовое производство было налажено во время Второй мировой войны, и это спало огромное количество жизней. По сей день антибиотиками лечатся миллионы людей, хотя за последние сто лет появилось множество других методов для борьбы с бакинфекциями. 

Долгое время антибиотики являлись основой лечения бактериальных инфекций, но за последние десятилетия бактерии приспособились к ним, мутировали и стали менее восприимчивыми к разным группам антибиотиков (резистентными). Конечно, фармацевтика не стоит на месте, создаются новые, улучшенные препараты, но всегда нужны запасные варианты и «план Б». Именно поэтому сейчас активно развиваются альтернативные методы борьбы с бакинфекциями. 

Минусы антибиотиков:

  1. Большое количество противопоказаний (детский возраст, беременность, кормление грудью и др.).

  2. Частые аллергические реакции.

  3. Отрицательное воздействие на микрофлору кишечника: антибиотики широкого спектра «убивают» не только болезнетворные, но и полезные бактерии, необходимые для здоровья человека. 

  4. И самая главная проблема – резистентность, то есть устойчивость организма к их воздействию. 

Семнадцать лет назад, когда я только начала учиться в медицинском колледже, самым любимым и действующим препаратом у медиков был один известный антибиотик – его назначали направо и налево, так как он был действительно эффективным и имел мало побочных реакций. Сейчас на своём опыте работы врачом-педиатром я вижу, что этот препарат действует не каждый раз. А всё потому, что бактерии адаптировались к этому препарату и мутировали, поэтому лечение часто является неэффективным. И так не только с этим антибиотиком, но и со многими другими. 

Поэтому всё чаще для лечения бактериальной инфекции назначают бактериофаги. Кстати, открыли бактериофаги на десять лет раньше пенициллина, но в связи с широким применением антибиотиков про бактериофаги надолго забыли. 

Бактериофаги – это вирусы, которые поражают бактериальные клетки. Чем же хороши бактериофаги в лечении бактериальной инфекции? 

Основные плюсы бактериофагов: 

  1. Очень низкая вероятность развития резистентности и аллергических реакций.

  2. Узконаправленность, то есть определённый бактериофаг действует на определённую бактерию, при этом остальная микрофлора организма человека остается неизменной.

  3. И самый большой плюс – отсутствие противопоказаний из-за того, что фаги не влияют на процессы, проходящие в организме. 

Но всё же с большим количеством преимуществ бактериофаги не являются заменой антибиотикам, а лишь альтернативным вариантом лечения. 

Зато в отношении золотистого стафилококка на данный момент бактериофаги являются ключевым препаратом. Золотистый стафилококк – хитрая бактерия, которая отлично мутирует, тем самым приобретая устойчивость к антибиотикам. Очень часто такой стафилококк встречается в стенах медицинских учреждений и называется «внутрибольничной инфекцией». Для выявления этой бактерии берут мазки на чувствительность. При выявлении золотистого стафилококка назначают стафилококковый бактериофаг. Лечение продолжается курсом от 2 до 4 недель. Затем снова берётся мазок на чувствительность для выявления успешности лечения.  Бактериофаг помогает в подавляющем большинстве случаев, но иногда бывают исключения – все мы разные, поэтому не бывает одной «волшебной таблетки», которая всех излечит от всех болезней.

Видов бактериофагов много – стрептококковый, клебсиеллёзный, пиобактериофаг, протейный, колипротейный и др. – в нашей стране применяется в общей сложности 13 препаратов на основе фагов. Самый известный – дизентерийный бактериофаг: благодаря ему предотвратили дизентерийную эпидемию после больших наводнений в крупных городах России.

Быстрая регистрация
Получите 5% скидку на первый заказ!

Многие гастроэнтерологи говорят о том, что лечение бакинфекции нужно начинать именно с фагов – тогда риск возникновения осложнений меньше. Бывает так, что анализ выявляет, что к фагам у бактерии резистентность, в то время как чувствительность есть только к антибиотикам определённой группы. Поэтому если ситуация не критическая, то лечение нужно начинать с бактериофагов, а антибиотики оставить как запасной вариант. Вот такие это волшебные вирусы, которые не губят, а восстанавливают здоровье людей.

А как вы относитесь к лечению антибиотиками и бактериофагами?


Поделитесь в комментариях!

Бактериофаг стафилококковый жидкий 100 мл фл/пач карт x1

Торговое наименование:
Бактериофаг стафилококковый жидкий (Bacteriophage Staphylococci fluid)

Международное наименование:
Бактериофаг стафилококковый (Bacteriophagum Staphylococcum)

Формы выпуска:
раствор для приема внутрь и местного применения (флаконы) 20, 50, 100 мл

Состав:
бактериофаг стафилококковый

Фармокологичекая группа:
МИБП-бактериофаг

Фармокологичекая группа по АТК:
V03A (Другие терапевтические продукты)

Описание:
Препарат представляет собой стерильный фильтрат фаголизата стафилококковых бактерий. Специфическая активность для жидкого препарата должна быть не ниже 10(-5) и не ниже 10(-4) для мази и свечей по методу Аппельмана. Жидкий бактериофаг – прозрачная жидкость желтого цвета различной интенсивности. В качестве консерванта применяется хинозол. Мазь и свечи имеют гомогенную консистенцию кремового цвета различной интенсивности.

Показания:
Лечение и профилактика гнойных инфекций кожи, слизистых, висцеральных органов, вызванных стафилококковыми бактериями, а также при дисбактериозах. Бактериофаг применяется для лечения: фурункулов, карбункулов, гидроаденитов, абсцессов, гнойноосложненных ран, инфицированных стафилококками, плевритов, бурситов, термических ожогов, хронических остеомиелитов, флегмон, тендовагинитов, маститов, циститов, холециститов, при глубоко инфильтрированном и абсцедированном стафилококковом сикозе, ангине, энтероколите и др., а также с профилактической целью при свежеинфицированных ранах (при операциях брюшной и грудной полости, уличном и производственном травматизме и др.). Препарат для лечения применяется при выделении от больных штаммов стафилококка, чувствительных к фагу.

Режим дозирования:
Основным условием успешного использования бактериофага является раннее применение препарата, отвечающего этиологии заболевания, и возможно непосредственное его введение в очаг инфекции. В зависимости от характера очага инфекции бактериофаг применяется: местно – в виде орошения, примочек и тампонирования жидким фагом, в количестве до 200 мл в зависимости от размеров пораженного участка, или смазывания мазью. При фурункулах и карбункулах жидкий препарат можно вводить непосредственно в очаг или под основание инфильтрата, а также вокруг очага путем обкалывания. Инъекции бактериофага производят ежедневно или через день в зависимости от реакции в последовательно возрастающих дозах:на 1 инъекцию – 0.5 мл, затем 1.0, 1.5, 2.0 мл. Всего за цикл лечения проводят 3 – 5 инъекций. При абсцессе бактериофаг вводят в полость очага после удаления гноя с помощью пункции, количество вводимого препарата должно быть несколько меньшим объема удаленного гноя. Гной может быть удален также путем вскрытия абсцесса с последующим введением в полость тампона, обильно смоченного бактериофагом. При хронических остеомиелитах после соответствующей хирургической обработки в рану вливают стафилококковый бактериофаг, для лечения глубоких форм пиодермитов препарат применяют внутрикожно в малых дозах, 0.1 – 0.5 мл в одно место или при необходимости до 2 мл в нескольких местах. Всего 10 инъекций, через каждые 24 ч., введение в полости – брюшную, плевральную, суставную и другие – до 100 мл бактериофага, после чего полость наглухо зашивают или оставляют капиллярный дренаж, через который в течение нескольких дней повторно вводят бактериофаг. При циститах бактериофаг вводят в мочевой пузырь через катетер. При гнойных плевритах, бурситах или артритах бактериофаг вводят в полость (после удаления гноя) в количестве до 200 мл и больше, через день, всего 3 – 4 раза, при кишечных формах заболевания, вызванных стафилококком и дисбактериозом. Жидкий бактериофаг применяют per os и per rectum при помощи клизмы и путем введения ректальных свечей. Per os бактериофаг дают 2 раза в сутки натощак за 1.5 – 2 ч. до приема пищи и per rectum один раз в сутки.

Рекомендуемая доза препарата на один прием. От 0 до 6 месяцев 5-10 мл , в клизме 20 мл, 1 свеча. От 6 до 12 месяцев 10-15 мл, в клизме 20 мл, 1 свеча. От года до 3 лет 15-20 мл, в клизме 40 мл, 1 свеча. Старше 3 лет 20-50 мл, в клизме 40-100 мл, 1 свеча. Детям первых дней жизни в первые два дня приема препарата бактериофаг разводить кипяченой водой в 2 раза, в случае отсутствия побочных реакций (срыгивание, высыпание на коже) в дальнейшем препарат применять не разведенным.

При дисбактериозе лечение проводят в течение 7 – 10 дней под бактериологическим контролем. Бактериофаг стафилококковый в аэрозольной упаковке применяется с лечебной и профилактической целью местно в виде орошения инфицированных стафилококком пораженных кожных покровов и слизистых при ожогах, гнойно-воспалительных процессах, инфицированных ранах, а также при ангинах. Стафилококковый бактериофаг применяют для профилактики в количестве до 50 мл, для орошения послеоперационной раны и т.д. Можно также производить комбинированное лечение стафилококковым бактериофагом в сочетании с антибиотиками. Применение бактериофага не исключает применения других лекарственных препаратов.

Противопоказания:
Нет.

Побочные действия:
Осложнений при введении препарата нет. При внутрикожном введении может наблюдаться быстро проходящее покраснение и воспаление.

Фармакодинамика:
Стафилококковый бактериофаг обладает способностью специфически лизировать стафилококковые бактерии, выделенные при гнойных инфекциях.

Условия хранения:
Бактериофаг хранят при температуре (6 +-4)град.С в сухом темном месте. Транспортирование производят всеми видами крытого транспорта в условиях, исключающих замерзание препарата, при температуре не выше 10град.С.

Срок годности:
1 год. Дополнительный срок годности после переконтроля – 6 месяцев. Переконтроль производят при наличии на складе не менее 500 ампул.

Номер регистрации препарата:
94/161/133

Бактериофаг стафилококковый 20мл N4 в Пушкино

Показания

Лечение и профилактика гнойных инфекций кожи, слизистых висцеральных органов, вызванных стафилококковыми бактериями, а также при дисбактериозах. Бактериофаг применяется для лечения фурункулов, карбункулов, гидроадентов, абсцессов, гнойноосложненных ран, инфицированных стафилококками, плевритов, бурситов, термических ожогов, хронических ожогов, хронических остеомиелитов, флегмон, тендовагинитов, маститов, циститов, холицеститов, при глубоко инфильтрированном и абсцедированном стафилококковом сикозе, ангине, энтероколите и др., а также с профилактической целью при свежеинфицированных ранах (операции брюшной и грудной полости, уличный и производственный травматизм и др.)

Состав

Фильтрат фаголизатов активный против стафилококка золотистого.

Свойства

Препарат должен вызывать специфический лизис золотистого стафилококка.

Режим дозирования

Основными условиями использования бактериофага является раннее применение препарата, отвечающего этиологии заболевания, непосредственное его введение в очаг инфекции. В зависимости от характера очага инфекции бактериофаг применяется: 1.) Местно в виде орошения, примочек и тампонирования жидким фагом в количестве до 200 мл, в зависимости от размеров пораженного участка, или смазывания мазью. При фурункулах и карбункулах жидкий препарат можно вводить непосредственно в очаг или под основание инфильтрата, а также вокруг очага путем обкалывания. Инъекции бактериофага производят ежедневно или через день в зависимости от реакции в последовательно возрастающих дозах: на 1 инъекцию-0.5 мл, затем 1.0; 1.5; 2.0 мл. Всего за цикл лечения производят 3-5 инъекций. При абсцессах бактериофаг вводят в полость очага после удаления гноя с помощью пункции, количество вводимого препарата должно быть несколько меньше объема удаленного гноя. Гной может быть удален путем вскрытия абсцесса с последующим введением в полость тампона, обильно смоченного бактериофагом. При хронических остеомиелитах после соответствующей хирургической обработки в рану вливают стафилококковый бактериофаг. 2.) Для лечения глубоких форм пиодермитов препарат применяют внутрикожно в малых дозах 0.1 – 0.5 мл в одно место или при необходимости до 2 мл в нескольких местах. Всего 10 инъекций через каждые 24 часа. 3.) Введение в полости-брюшную, плевральную, суставную и другие до 100 мл бактериофага, после чего полость наглухо зашивают или оставляют капиллярный дренаж, через который в течение нескольких дней повторно вводят бактериофаг. При циститах бактериофаг вводят в мочевой пузырь через катетер. При гнойных плевритах, бурситах или артритах бактериофаг вводят в полость (после удаления гноя) в количестве до 200 мл и больше, через день, всего 3-4 раза. 4.) При кишечных формах заболевания, вызванных стафилококком, и дисбактериозе жидкий бактериофаг применяют per os и per rectum при помощи клизмы или путем введения ректальных свечей. Per os бактериофаг дают 2 раза в сутки натощак за 1,5-2 часа до приема пищи и per rectum-один раз в сутки.

Рекомендуемые дозировки препарата

Возраст

Доза на один прием

(мл)

в клизме(мл)

свечи

0-6 месяцев

5-10 мл

20 мл

1

6-12 месяцев

10-15 мл

20 мл

1

1-3 года

15-20 мл

40 мл

1

старше 3 лет

20-50 мл

40-100 мл

Детям первых дней жизни в первые два дня приема препарата бактериофаг разводить кипяченой водой в 2 раза. В случае отсутствия побочных реакций (срыгивание, высыпание на коже) в дальнейшем препарат применять неразведенным. При дисбактериозе лечение проводят в течение 7-10 дней под бактериологическом контролем. Стафилококковый бактериофаг применяют для профилактики в количестве до 50 мл, для орошения послеоперационной раны и т.д.

Лекарственное взаимодействия

Можно производить комбинированное лечение стафилококковым бактериофагом в сочетании с антибиотиками. Применение бактериофага не исключает применение других лекарственных препаратов.

Побочное действие

Осложнений при введении препарата нет. При внутрикожном введении может наблюдаться быстропроходящее покраснение и воспаление.

Условия и сроки хранения

При температуре от +2 до +10 С в сухом темном месте.

Срок годности 1 год.

Бактериофаг и антибиотик избавили пациента от лекарственно-устойчивой инфекции

Прикрепление бактериофагов к поверхности бактериальной клетки. Фотография сделана с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Увеличение примерно в 200 тысяч раз.

Dr Graham Beards / Wikimedia Commons

Бактериофаг OMKO1 с антибиотиком цефтазидимом смог избавить пациента от инфекции, которую несколько лет безуспешно лечили традиционными антибиотиками, сообщается в Evolution, Medicine and Public Health. Пациенту с аневризмой аорты был установлен имплантат, но после операции у него развилась инфекция, вызванная синегнойной палочкой (Pseudomonas aeruginosa).

Синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) обладает повышенной устойчивостью к большинству антибиотиков и относится к так называемым ESKAPE-патогенам — бактериям, вызывающим госпитальные инфекции по всему миру. В том числе она обнаруживается при абсцессах и гнойных ранах. Лечение инфекций, вызванных P. aeruginosa осложняется тем, что бактерии образуют на поверхности пораженного органа биопленки. Антибиотики на это бактериальное сообщество не действуют, а уничтожают только отдельные (планктонные) бактерии, которые испускает биопленка.

Для уничтожения ESKAPE-патогенов исследователи пробуют альтернативные варианты, в том числе лечение бактериофагами. Бактериальные вирусы могут проникать в биопленку и уничтожать бактерии, из которых она состоит. Метод лечения бактериофагами начали разрабатывать почти 100 лет назад, вскоре после открытия этих микроорганизмов. Однако у этого метода обнаружились недостатки: процедура подбора нужных фагов, действующих на тот или иной вид бактерий, занимает как минимум несколько дней, обработать ими можно только наружные поверхности организма или кишечник, к тому же фаги начинают размножаться при большой концентрации бактерий, уничтожение которых может вызвать у пациента токсический шок. К тому же, бактерии вырабатывают к бактериофагам устойчивость, как и к антибиотикам, поэтому в настоящее время бактериофаги используют достаточно редко.

Ученые из Йельского университета под руководством хирурга Дипака Нараяна (Deepak Narayan) и эволюционного биолога Пола Тернера (Paul Turner) решили использовать бактериофаг OMKO1 для лечения пациента с тяжелой госпитальной инфекцией. В 2012 году 76-летнему пациенту прооперировали аневризму дуги аорты и установили дакроновый имплантат. Вскоре после операции у пациента развилась инфекция, вызванная синегнойной палочкой. Для борьбы с ней мужчине неоднократно проводили хирургические чистки грудной клетки (делали дренажное отверстие, через которое выходил гной) и прописывали многократные продолжительные курсы антибиотиков. Но лечение не помогало, состояние пациента ухудшалось. Медики считали, что проводить повторную операцию было слишком рискованно, и приняли решение провести экспериментальное лечение бактериофагом и антибиотиком цефтазидимом, который применяется для лечения синегнойной палочки.

В качестве кандидата они выбрали фаг OMKO1, который был получен из образцов прудовой воды. Исследователи взяли их в пруду Додж в 65 километрах от Йельского университета. Как выяснили авторы исследования в своей предыдущей работе, OMKO1 прикрепляется к мембране синегнойной палочки, точнее, к белку-насосу, который «откачивает» антибиотик из клетки, прежде чем тот успевает подействовать. Исследователи предположили, что P. aeruginosa выработала устойчивость к фагу с помощью мутаций в мембранном насосе, которые препятствовали связыванию OMKO1. Но эти же мутации уменьшают эффективность «насоса» и делают бактерию уязвимой к антибиотику. Поэтому, по мнению ученых из Йеля, комбинированная терапия должна была помочь пациенту.

Схема действия лекарства, предложенная учеными. Антибиотик в терапевтических концентрациях не может проникнуть в биопленки из-за ее плохой проницаемости и угнетенного метаболизма ее компонентов. Но фаг OMKO1 способен размножаться в бактериях, образующих пленку. В результате, стабильность бактериальной пленки нарушается, а потом она начинает разрушаться. И тогда даже терапевтические количества антибиотика действуют на патогены. А бактерии, устойчивые к фагу, становятся более чувствительными к антибиотику.

Benjamin Chan et al. / Evolution, Medicine and Public Health

Прежде чем проводить лечение, авторы работы провели лабораторные эксперименты и убедились в эффективности действия цефтазидима и фага на биопленки синегнойной палочки, которая была получена из выделений пациента. Исследователи предположили, что OMKO1 уничтожает отдельные бактерии, дестабилизируя бактериальную пленку. После этого уже антибиотик получает доступ к отдельным бактериям, устойчивым к фагу, и уничтожает их.

В 2016 году, после успеха лабораторных экспериментов, и получения разрешения на операцию от FDA и администрации университета, медики ввели в грудную клетку пациента суспензию фага OMKO1 и цефтазидима. После процедуры ему прописали короткий курс цефтазидима. В результате, в течение 18 месяцев (до подачи статьи в печать) рецидивов инфекции у мужчины не наблюдалось.

Недавно сингапурские исследователи синтезировали полимер, которые эффективно разрушает ESKAPE-патогены, в том числе и синегнойную палочку. В отличие от антибиотиков, новое вещество малотоксично и не вызывает возникновения устойчивости у бактерий.

Екатерина Русакова

Безопасность терапии бактериофагами при тяжелой инфекции, вызванной Staphylococcus aureus

  • Asgeirsson, H., Thalme, A. & Weiland, O. Staphylococcus aureus Бактериемия и эндокардит – эпидемиология и исход: обзор. Заразить. Дис. 50 , 175–192 (2018).

    Артикул Google ученый

  • Grubitzsch, H. et al. Хирургия эндокардита протезированного клапана: связь между заболеваемостью, смертностью и затратами. Взаимодействие. Кардиов. Т. 22 , 784–791 (2016).

    Артикул Google ученый

  • Watts, G. Фаговая терапия: возрождение ушедшей противомикробной терапии. Ланцет 390 , 2539–2540 (2017).

    Артикул Google ученый

  • Lehman, S.M. et al. Дизайн и доклиническая разработка фагового продукта для лечения устойчивых к антибиотикам инфекций Staphylococcus aureus . Вирусы 11 , 88 (2019).

    КАС Статья Google ученый

  • Ooi, M.L. et al. Безопасность и переносимость терапии бактериофагами при хроническом риносинусите, вызванном Staphylococcus aureus . JAMA Отоларингол. Хирургия головы и шеи. 145 , 723–729 (2019).

    Артикул Google ученый

  • Парк, Л.П. и др. Валидированная оценка риска для прогнозирования 6-месячной смертности при инфекционном эндокардите. Дж. Ам. Сердечный доц. 5 , e003016 (2016).

    Артикул Google ученый

  • Дурак Д. Т., Люкс А. С. и Брайт Д. К. Новые критерии диагностики инфекционного эндокардита: использование специфических эхокардиографических данных. Служба эндокардита Герцога. утра. Дж. Мед. 96 , 200–209 (1994).

    КАС Статья Google ученый

  • Bouchiat, C. et al. Staphylococcus aureus инфекционный эндокардит против штаммов бактериемии: на карту поставлены тонкие генетические различия. Заразить. Жене. Эвол. 36 , 524–530 (2015).

    КАС Статья Google ученый

  • Австралийская группа по устойчивости к противомикробным препаратам Австралийская программа оценки последствий сепсиса Staphylococcus aureus (ASSOP), Годовой отчет за 2015 г. (ред. Coombs et al.) (Commun. Dis. Intell., 2018).

  • Фабижан, А. П., Бен Закур, Н. Л., Хо, Дж., Лин, Р. С. Ю., Иределл, Дж. Поликлональный Staphylococcus aureus бактериемия. Препринт на https://annals.org/aim/article-abstract/2751455/polyclonal-staphylococcus-aureus-bacteremia (2019).

  • Джинн, А. Н. и др. Количественная мультиплексная тандемная ПЦР для прямого выявления бактериемии у пациентов в критическом состоянии. Патология 49 , 304–308 (2017).

    КАС Статья Google ученый

  • Шули, Р. Т. и др. Разработка и использование персонализированных лечебных коктейлей на основе бактериофагов для лечения пациентов с диссеминированной резистентной инфекцией Acinetobacter baumannii . Антимикроб. Агенты Чемотер. 61 , e00954-17 (2017).

    Артикул Google ученый

  • Лин Р.C.Y. и соавт. PI3K(p110α) защищает от сердечной недостаточности, вызванной инфарктом миокарда. Артериоскл. Васк. Тром. 30 , 724–732 (2010).

    КАС Статья Google ученый

  • Абедон, С. Фармакология фаготерапии: расчет дозировки фага. Доп. заявл. микробиол. 77 , 1–40 (2011).

    Артикул Google ученый

  • Горский А.и другие. Фаги и иммуномодуляция. Будущее микробиол. 12 , 905–914 (2017).

    КАС Статья Google ученый

  • Quan, H. et al. Обновление и проверка индекса коморбидности Чарлсона и оценки для корректировки риска в выписках из больницы с использованием данных из 6 стран. утра. Дж. Эпидемиол. 173 , 676–682 (2011).

    Артикул Google ученый

  • Капуццо, М.и другие. Валидация систем оценки тяжести SAPS II и APACHE II в одноцентровой популяции. Интенсивная терапия Мед. 26 , 1779–1785 (2000).

    КАС Статья Google ученый

  • Лопес, Дж. А. и Хорхе, С. Классификации RIFLE и AKIN для острого повреждения почек: критический и всесторонний обзор. клин. Kidney J. 6 , 8–14 (2013).

    Артикул Google ученый

  • Петрович А., Kostanjsek, R., Rakhely, G. & Knezevic, P. Первые бактериофаги семейства Siphoviridae, инфицирующие Bordetella bronchiseptica , выделенных из окружающей среды. Микро. Экол. 73 , 368–377 (2017).

    КАС Статья Google ученый

  • Фахардо-Лубиан, А., Бен Закур, Н. Л., Агиекум, А., Ци, К. и Иределл, Дж. Р. Адаптация хозяина и конвергентная эволюция повышают устойчивость к антибиотикам без потери вирулентности основного патогена человека. PLoS Патог. 15 , e1007218 (2019).

    Артикул Google ученый

  • Maddocks, S. et al. Бактериофаговая терапия вентилятор-ассоциированной пневмонии и эмпиемы, вызванной Pseudomonas aeruginosa . утра. Дж. Дыхание. крит. Уход Мед. 200 , 1179–1181 (2019).

    Артикул Google ученый

  • Границы | Оценка стафилококкового бактериофага Sb-1 в качестве дополнительного агента к антибиотикам против биопленок, устойчивых к рифампину Staphylococcus aureus

    Введение

    Staphylococcus aureus является одним из наиболее распространенных микроорганизмов, вызывающих инфекции, связанные с имплантатами, такие как перипротезные инфекции суставов (ПИС), инфекции, связанные с переломами (FRI), или инфекции, связанные с имплантатами позвоночника (Tong et al., 2015). Патогенез включает колонизацию устройства микроорганизмами, что приводит к образованию биопленки на поверхности имплантата, что затрудняет лечение этих инфекций. Оптимальное лечение предполагает санацию и сохранение имплантата (при острых инфекциях) или санацию с удалением нежизнеспособного материала и заменой имплантата, содержащего зрелую биопленку (при хронических инфекциях) (Izakovicova et al., 2019). В обеих клинических ситуациях требуется эрадикация биопленки при длительном применении биопленкоактивных антибиотиков (Sendi et al., 2008).

    Лечение инфекций, связанных с имплантатами, вызванных S. aureus , состоит из начальной внутривенной антибиотикотерапии, включая нафциллин, оксациллин, флуклоксациллин, цефазолин или фосфомицин против метициллин-чувствительных штаммов S. aureus (MSSA), а также ванкомицин, даптомицин, или фосфомицин против метициллин-резистентного S. aureus (MRSA). Кроме того, рифампицин добавляют для лечения стафилококковых инфекций у пациентов, перенесших хирургическую обработку раны с ретенцией или реимплантацию имплантата при одно- или двухэтапной замене (Berbari et al., 2020). Рифампицин следует назначать одновременно с другим активным антибактериальным средством, поскольку в противном случае быстро возникает резистентность к рифампину (Hoiby et al., 2015). С увеличением использования рифампина во всем мире увеличивается количество устойчивых к рифампину штаммов стафилококков, что представляет серьезную проблему. Например, в Китае устойчивость к рифампину изолятов MRSA увеличилась с 15,5 до 50,2% за 4 года (2004–2008 гг.) (Wang C. et al., 2019). В отношении мутантов, устойчивых к рифампину, рифампин не обладает биопленочной активностью in vitro или in vivo (Croes et al., 2010). Таким образом, были исследованы альтернативные антимикробные агенты (например, даптомицин, фосфомицин и далбаванцин), но ни один из них не показал биопленочной активности in vivo . Другой альтернативой является комбинация антибиотиков с литическими бактериофагами. Литические бактериофаги могут проявлять быструю бактерицидную активность, разрушающие биопленки свойства и способность усиливать антибиотическую активность (Tkhilaishvili et al., 2018) и поэтому рассматриваются как альтернативные стратегии борьбы с бактериальными инфекциями (Reardon, 2014).

    Фаг

    Sb-1 является одним из наиболее хорошо охарактеризованных и полностью секвенированных литических стафилококковых фагов , разработанных Институтом Элиавы в Грузии в качестве противоинфекционной терапии для применения на людях (Кутатателадзе и Адамия, 2008). Его геном не содержит генов, ассоциированных с вирулентностью бактерий, что делает его пригодным для антимикробной терапии (Квачадзе и др., 2011). Более того, Sb-1 успешно применялся в бывшем Советском Союзе для лечения 90 004 инфекций, вызванных S. aureus 90 005, у различных пациентов (Сулаквелидзе и соавт., 2001). Однако имеется ограниченное количество исследований in vitro и исследований in vivo , опубликованных в отношении активности комбинации фаг-антибиотик против штаммов S. aureus . Наше предыдущее исследование показало хорошую синергетическую активность фага Sb-1 и антибиотиков в отношении MRSA ATCC 43300 (Tkhilaishvili et al., 2018). В этом исследовании мы оценили эффективность различных классов антибиотиков (ванкомицин, даптомицин, фосфомицин, гентамицин, флуклоксациллин, цефазолин и рифампин) отдельно или в комбинации с Sb-1 при одновременном или поэтапном применении против 10 устойчивых к рифампину С.aureus (RRSA) (четыре MRSA и шесть MSSA) и лабораторные штаммы MRSA ATCC 43300 и MSSA ATCC 29213.

    Материалы и методы

    Бактерии и бактериофаги

    В это исследование были включены десять клинических изолятов RRSA, собранных в период с 2015 по 2019 год. Клинические изоляты были использованы из коллекции биобанка, которая является частью предполагаемой институциональной когорты PJI. Исследование было одобрено институциональным этическим комитетом (EA1/040/14) и проводилось в соответствии с последней версией Хельсинкской декларации.В соответствии с этическим одобрением информированное согласие участников было отклонено, а все данные были псевдонимизированы. Кроме того, в этом исследовании использовались лабораторные стандартные штаммы MRSA ATCC 43300 и MSSA ATCC 29213. Бактерии хранили при температуре -80°С с использованием системы консервации криопробирок (Microbank; Pro-Lab Diagnostics, Канада). Стафилококковый фаг Sb-1 был предоставлен Институтом Элиава (Тбилиси, Грузия) и хранился при 4°С.

    Антимикробные агенты и тестирование чувствительности

    Ванкомицин (0.5 г, Hexal, Хольцкирхен, Германия), даптомицин (0,5 мг, Novartis Pharma Schweiz, Базель, Швейцария), фосфомицин (5 г, InfectoPharm, Heppenheim, Германия), раствор гентамицина для инъекций (40 мг/мл, Ratiopharm, Ульм, Германия) ), флуклоксациллин (2 г, Stragen Pharma, Бад-Хомбург, Франция), цефазолин (2 г, MIP Pharma, Блискастель-Нидервюрцбах, Германия) и рифампин (6 г, Sandoz Pharmaceuticals, Штайнхаузен, Швейцария) были предоставлены соответствующими производителями. .

    MIC для каждого антибиотика определяли с помощью анализа макроразведений в бульоне (BMD) в бульоне для инфузии мозга и сердца (BHI; BD, Le Pont de Claix, Франция).Использовали инокулят приблизительно 5×10 5 КОЕ/мл. Готовили двухкратные серийные разведения каждого антибиотика в стерильных полистироловых круглодонных пробирках до конечного объема 1 мл в посевной среде и инкубировали в течение 24 ч при 37°С. МИК определяли как наименьшую концентрацию антибиотика, которая полностью ингибировала видимый рост. В бульонную среду BHI добавляли хлорид кальция (40 мкг/мл) и глюкозо-6-фосфат (25 мкг/мл) при тестировании даптомицина и фосфомицина соответственно.Все эксперименты проводились в трехкратной повторности.

    Восприимчивость бактерий к Sb-1 оценивали с точки зрения эффективности посева (EOP), как описано ранее (Wang et al., 2016). Значение EOP рассчитывали как отношение между бляшкообразующими единицами (БОЕ) тестируемых клинических штаммов по отношению к штамму MRSA ATCC 43300, определяемому как бактерия-хозяин (EOP = титр фага на тестируемой бактерии/титр фага на бактерию-хозяина). ). Значения ЭОП 0,5–1 расценивались как «высокая» эффективность; 0.2–0,5 как «средний» КПД; 0,001–0,2 — «низкий» КПД; 0,0 считался неэффективным против целевого штамма (Viazis et al., 2011).

    Оценка активности антибиопленки с помощью изотермической микрокалориметрии и обработки ультразвуком/подсчета колоний

    Антибиопленочную активность отдельных антибиотиков и комбинации фаг-антибиотик определяли с помощью изотермической микрокалориметрии (ИМК), как сообщалось ранее (Tkhilaishvili et al., 2018). Вкратце, образование биопленки проводили путем инкубации пористых стеклянных шариков (ROBU, Hattert, Germany) в инокулированной среде BHI при 37°C в течение 24 часов.Затем шарики промывали (3 раза) стерильным 0,9% NaCl для удаления планктонных клеток и подвергали воздействию свежего BHI, содержащего антибиотик. Через 24 ч инкубации при 37°С гранулы промывали (3 раза) 0,9% солевым раствором и помещали в ампулы для микрокалориметрии, содержащие 3 мл свежего BHI, и помещали в калориметр. Минимальную бактерицидную концентрацию биопленки (МББК) определяли как наименьшую концентрацию антибиотика, приводящую к отсутствию теплопродукции после 48 ч инкубации при 37°С. Эффект комбинированного лечения (антибиотик + Sb-1) оценивали путем одновременного или поэтапного применения 10 6 БОЕ/мл фага Sb-1 и суб-MBBC концентраций антибиотиков.При одновременном нанесении биопленки подвергали воздействию антибиотиков и Sb-1 в течение 24 ч при 37°С. При ступенчатом нанесении биопленки сначала подвергали воздействию Sb-1 в течение 24 часов, а затем антибиотику еще в течение 24 часов при 37°C. Оценка поэтапного применения антибиотика с последующим применением фага была отклонена на основании неблагоприятных результатов, наблюдавшихся в предыдущих исследованиях (Kumaran et al., 2018; Tkhilaishvili et al., 2018).

    Для образцов, в которых не было обнаружено выделение тепла, полное уничтожение биопленки определяли путем подсчета КОЕ гранул, обработанных ультразвуком, после микрокалориметрического анализа, а минимальную концентрацию, разрушающую биопленку (MBEC), определяли как самую низкую концентрацию антибиотика, необходимую для уничтожения всех прилипшие бактерии, что приводит к отсутствию какого-либо роста после обработки ультразвуковой жидкостью (предел обнаружения: <20 КОЕ/мл) (Gonzalez Moreno et al., 2019). Все эксперименты проводились в трехкратной повторности.

    Влияние комбинаций фаг-антибиотик на биопленки оценивали, как и в предыдущем исследовании (Ryan et al., 2012), определяя соотношение MBEC фаг / MBEC отдельно , где MBEC фаг соответствует полученному значению MBEC антибиотика, тестируемого в комбинации с фагом, и MBEC отдельно представляет собой полученное значение MBEC того же антибиотика при тестировании отдельно. Синергия определялась как отношение ≤ 0.25, что коррелирует со снижением более чем в 2 раза MBEC в отдельности . Мы комбинировали и тестировали только те концентрации антибиотика, которые могли выявить синергетический эффект с Sb-1 на основе значений MBEC одного антибиотика, который нужно комбинировать (антибиотики, представляющие только MBEC > 1,024 мкг/мл, тестировались в комбинации с Sb-1). 1 при повышении концентрации до 256 мкг/мл).

    Результаты

    Бактериальная чувствительность к обычным антибиотикам и Sb-1

    Антимикробная активность антибиотиков в отношении планктонных и биопленочных S.aureus определяли по BMD и посеву жидкости для ультразвуковой обработки соответственно. Полученные значения MIC и MBEC суммированы в таблице 1. Кроме того, значения MBBC, оцененные с помощью IMC, и влияние Sb-1 на биопленку обоих штаммов ATCC показаны на дополнительных рисунках S1, S2.

    Таблица 1. Чувствительность к противомикробным препаратам планктонных (MIC) и биопленочных (MBEC) штаммов Staphylococcus aureus , определенная с помощью стандартного анализа макроразведений в бульоне и обработки ультразвуком/подсчета колоний.

    Оба штамма ATCC были чувствительны ко всем антибиотикам в соответствии с пограничными значениями EUCAST (EUCAST, 2020), за исключением MRSA ATCC 43300, устойчивого к гентамицину. 10 штаммов RRSA были чувствительны ко всем антибиотикам, кроме MRSA4, устойчивого к фосфомицину, и MSSA5, устойчивого к гентамицину. Все протестированные штаммы были чувствительны к более высоким концентрациям антибиотиков (от 64 до > 1024 мкг/мл) при выращивании в виде биопленок по сравнению со значениями МИК, полученными для планктонных бактерий.

    Антибиопленочную активность различных антибиотиков в отношении штаммов ATCC оценивали путем мониторинга в течение 48 часов тепла, выделяемого биопленочными бактериями, все еще жизнеспособными на гранулах (после воздействия антибиотиков), повторно инокулированных в свежую среду (дополнительный рисунок S1). С одной стороны, MRSA ATCC 43300 был чувствителен к даптомицину и рифампицину в концентрациях 128 и 256 мкг/мл соответственно, тогда как MSSA ATCC 29213 проявлял чувствительность к гентамицину и рифампицину в концентрациях 512 и 256 мкг/мл соответственно.Остальные антибиотики, протестированные до 1024 мкг/мл, не показали ингибирования продукции теплового потока на соответствующем штамме, что указывает на отсутствие антибиопленочной активности, несмотря на присутствие высоких концентраций антибиотика.

    Воздействие Sb-1 на биопленку обоих штаммов ATCC в течение 24 часов выявило отчетливый эффект на каждый штамм. Заметное снижение, но не полное ингибирование теплового потока по сравнению с тепловым потоком, создаваемым контролем роста, можно было наблюдать с обработанным штаммом MRSA, тогда как для MSSA почти не наблюдалось различий между контрольным и обработанным образцом (дополнительный рисунок S2). ).Все штамма S. aureus были восприимчивы к инфекции Sb-1, показывая соотношение EOP в диапазоне от 0,3 до 0,9 (дополнительная таблица S1), что свидетельствует о высокой литической активности (EOP 0,5–1) Sb-1 против большинства штаммов.

    Оценка комбинаций фаг-антибиотик против штаммов ATCC

    IMC исследовал синергетический эффект одновременного (рис. 1) и поэтапного (рис. 2) комбинаций фаг-антибиотик против биопленки обоих штаммов ATCC. Кроме того, наличие жизнеспособных бактерий, прикрепленных к шарикам после калориметрии тех образцов, которые не показали тепловыделения, оценивали путем подсчета колоний после обработки шариков ультразвуком и посева жидкостей для обработки ультразвуком.Полученные значения MBEC, а также рассчитанные отношения MBEC phage /MBEC отдельно приведены в таблице 2.

    Рисунок 1. Микрокалориметрический анализ метициллин-резистентных Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC 43300 (верхний ряд) и метициллин-чувствительных S. aureus (MSSA) ATCC 29213 (нижний ряд) биопленок, обработанных одновременно с Sb фаговые и субминимальные биопленочные бактерицидные концентрации (MBBC) концентрации антибиотиков.Каждая кривая показывает тепло, выделяемое жизнеспособными бактериями, присутствующими в биопленке, после 24 ч обработки фагом-антибиотиком. Цифры представляют концентрации (в мкг/мл) ванкомицина (VAN), даптомицина (DAP), фосфомицина (FOF), гентамицина (GEN), рифампина (RIF), флуклоксациллина (FLU) и цефазолина (CFZ). Значения, обведенные кружками, представляют собой MBBC, определяемую как самая низкая концентрация противомикробного препарата, приводящая к отсутствию повторного роста бактерий через 48 часов. GC, контроль роста; НК, отрицательный контроль. Приведены данные репрезентативного эксперимента.

    Рисунок 2. Микрокалориметрический анализ биопленок MRSA ATCC 43300 (верхний ряд) и MSSA ATCC 29213 (нижний ряд) после поэтапного применения фага Sb-1 в течение 24 часов с последующим 24-часовым воздействием антибиотиков в концентрациях ниже MBBC. Каждая кривая показывает тепло, выделяемое жизнеспособными бактериями, присутствующими в биопленке, после обработки фагом-антибиотиком. Цифры представляют концентрации (в мкг/мл) ванкомицина (VAN), даптомицина (DAP), фосфомицина (FOF), гентамицина (GEN), рифампина (RIF), флуклоксациллина (FLU) и цефазолина (CFZ).Значения, обведенные кружками, представляют собой MBBC, определяемую как самая низкая концентрация противомикробного препарата, приводящая к отсутствию повторного роста бактерий через 48 часов. GC, контроль роста; НК, отрицательный контроль. Приведены данные репрезентативного эксперимента.

    Таблица 2. Антибиопленочные эффекты одновременных или поэтапных комбинаций фаг-антибиотик.

    Среди всех одновременно протестированных комбинаций фаг-антибиотик против MRSA ATCC 43300 только воздействие на биопленку Sb-1 и суб-MBBC концентраций даптомицина или рифампина показало синергетический эффект.Напротив, самый сильный синергический эффект наблюдался при ступенчатом воздействии на MRSA ATCC 43300 Sb-1 и суб-MBBC концентраций ванкомицина или даптомицина, показывая самые низкие соотношения MBEC phage / MBEC отдельно , за которыми следовали фосфомицин и рифампицин ( Таблица 2), тогда как с гентамицином синергетический эффект не наблюдался, возможно, из-за профиля устойчивости этого штамма к гентамицину.

    Не наблюдалось синергетического эффекта комбинаций фаг-антибиотик против MSSA ATCC 29213, как одновременного, так и поэтапного.В целом, когда биопленка MRSA ATCC 43300 впервые подвергалась воздействию Sb-1 в течение 24 часов до воздействия концентрациями антибиотиков ниже MBBC, была получена более высокая задержка и/или снижение продукции теплового потока по сравнению с производимым тепловым потоком. когда биопленка подвергалась одновременному воздействию комбинаций фаг/антибиотик при тех же концентрациях антибиотика, тогда как в случае MSSA ATCC 29213 этот эффект не был столь заметным.

    Оценка комбинаций фаг-антибиотик против клинических штаммов, устойчивых к рифампину

    Staphylococcus aureus

    Способность комбинаций фаг-антибиотик уничтожать биопленку 10 клинических штаммов MRSA и MSSA, устойчивых к рифампину, была непосредственно оценена с помощью обработки ультразвуком/подсчета колоний, как описано ранее, и результаты представлены в таблице 3.

    Таблица 3. Антибиопленочные эффекты одновременных (MBEC SIM ) или ступенчатых (MBEC STA ) комбинаций фаг-антибиотик против клинических штаммов.

    Среди четырех изолятов MRSA синергический эффект наблюдался для всех штаммов после воздействия комбинации Sb-1/даптомицин (либо одновременно, либо в шахматном порядке), у трех штаммов (75%) при воздействии комбинации Sb-1/гентамицин в шахматном порядке и у двух (50%) штаммов, подвергшихся воздействию Sb1/фосфомицина в шахматном порядке или одновременному сочетанию Sb-1/гентамицина.Синергический эффект не наблюдался, когда биопленка тестируемых клинических штаммов подвергалась одновременному или поэтапному воздействию комбинации Sb-1/ванкомицин, в отличие от обнаружения штамма MRSA ATCC 43300.

    Среди шести изолятов MSSA синергетический эффект наблюдался у четырех штаммов (67%) после поэтапного воздействия Sb-1/флуклоксациллина или Sb-1/цефазолина и у трех штаммов (50%) при одновременном применении комбинации Sb-1/флуклоксациллин . Только ступенчатая, но не одновременная комбинация Sb-1/фосфомицин показала синергетический эффект против четырех штаммов (67%), тогда как одновременная или ступенчатая комбинация Sb-1/гентамицин показала синергизм против трех штаммов (50%).Ни одна из протестированных одновременных или ступенчатых комбинаций фаг/антибиотик не показала улучшения антимикробной активности по сравнению с действием каждого противомикробного агента по отдельности против биопленки MSSA5.

    Кроме того, не было обнаружено синергизма комбинации Sb-1 и рифампина против MRSA или MSSA (дополнительная таблица S2).

    Обсуждение

    Образование биопленки на поверхности устройства является ключевым явлением в патогенезе инфекций, связанных с имплантатами, что требует применения биопленочно-активных антибиотиков (Davidson et al., 2019). Рифампицин появился около тридцати лет назад в качестве антибиопленочного антибиотика против S. aureus инфекций, связанных с ортопедическими имплантатами (Zimmerli and Sendi, 2019), демонстрируя хорошее проникновение и биодоступность в костно-суставной ткани (Sendi and Zimmerli, 2017). В этом исследовании мы изучали альтернативы рифампину для лечения инфекций, связанных с имплантатами, вызванных RRSA.

    Описано, что эффективность фага зависит от специфичности хозяина, среди ряда других факторов (Ly-Chatain, 2014).В нашем исследовании Sb-1 продемонстрировал высокий киллирующий эффект в отношении большинства протестированных штаммов, но полной эрадикации биопленки с помощью одного только фага не удалось достичь, возможно, из-за установления равновесия между вирусом и хозяином, о чем сообщалось ранее (Głowacka-Rutkowska). et al., 2019), что можно было бы предотвратить добавлением антибиотиков.

    Комбинации фаг-антибиотик, протестированные в нашем исследовании, были выбраны на основе профиля устойчивости к метициллину изолятов S. aureus , как это обычно делается в клинических условиях (Berbari et al., 2020). Следовательно, в дополнение к тестированию фосфомицина и гентамицина против всех штаммов, даптомицин и ванкомицин были выбраны для тестирования на штаммах MRSA, а флуклоксациллин и цефазолин были выбраны для тестирования на штаммах MSSA. Для оценки комбинаций фаг-антибиотик было принято фиксированное значение 1024 мкг/мл для расчета соотношений MBEC фаг /MBEC отдельно для образцов с MBEC отдельно > 1024 мкг/мл. Следует отметить, что при таком подходе некоторые комбинации, которые были интерпретированы как несинергетические, могли оказывать синергетический эффект при тестировании более высоких значений MBEC.Однако наблюдаемые положительные синергетические эффекты комбинаций фаг-антибиотик с нашей экспериментальной установкой являются определенными и обычно представляют значительно более низкие значения MBEC по сравнению со значениями MBEC для отдельных антибиотиков.

    Определение соотношений EOP является частым тестом для выявления фагов, подходящих для фаговой терапии (Khan Mirzaei and Nilsson, 2015). Однако в нашем исследовании мы не наблюдали корреляции между рангом ЭОП и антибиопленочной активностью фага в отношении конкретного штамма.Например, Sb-1 продемонстрировал низкую эффективность против биопленки MSSA ATCC 29213 без синергетического эффекта в сочетании с антибиотиками, несмотря на высокий ранг EOP, но Sb-1 в сочетании с даптомицином приводил к синергетическому эффекту против MRSA3 и MRSA4, хотя и демонстрировал более низкие отношения EOP. на эти штаммы. Таким образом, в контексте использования фагов для контроля бактериальных биопленок определение соотношений EOP не должно быть неправильно истолковано в отношении корреляции с эффективностью против биопленок. Природа матрицы биопленки может различаться у разных штаммов, что в конечном итоге влияет на биодоступность и/или действие противомикробного препарата, как предположили Бауэр и его коллеги (Bauer et al., 2013), которые оценивали активность антибиотиков в отношении молодых и зрелых биопленок MSSA и MRSA и обнаружили, что, помимо зрелости биопленок, бактериальный штамм явно влиял на активность антибиотиков.

    Было показано, что порядок введения при сочетании антибиотиков и фагов играет ключевую роль в синергическом антимикробном эффекте (Dickey and Perrot, 2018; Kumaran et al., 2018). Мы наблюдали синергетический эффект, когда Sb-1 комбинировали с фосфомицином или цефазолином путем поэтапного применения, но не при одновременном применении этих антибиотиков и Sb-1.Более того, предварительное воздействие Sb-1 с последующим введением флукоксациллина уничтожало биопленку при более низких концентрациях антибиотика по сравнению с одновременным применением. Эти результаты действительно, по-видимому, указывают на то, что воздействие на биопленки сначала фага, а затем антибиотиков является наиболее эффективным способом их уничтожения. Предыдущие исследования показали преимущество ступенчатого применения при сочетании антибиотиков и фагов (Tkhilaishvili et al., 2018), в то время как одновременное воздействие может привести к снижению их антибиопленочной эффективности, возможно, из-за антагонистических механизмов действия (например,g., антибиотики, препятствующие процессу репликации бактериальной ДНК) или из-за уничтожения антибиотиком бактерий-хозяев, что необходимо для производства фагов (Chaudhry et al., 2017; Kumaran et al., 2018; Akturk et al. , 2019).

    С другой стороны, за исключением штамма MRSA ATCC, комбинация Sb-1 и даптомицина или ванкомицина против штаммов MRSA, устойчивых к рифампицину, показала тот же результат независимо от порядка введения. В предыдущем исследовании Dickey and Perrot (2018) авторы также показали, что одновременное лечение S.aureus с даптомицином и фагом была столь же эффективна, как и последовательная обработка. Более того, они показали антагонистический эффект при сочетании фага и ванкомицина. Учитывая, что стеночная тейхоевая кислота из бактериальной клеточной стенки является первичным рецептором стафилококкового фага (Azam and Tanji, 2019) и что ванкомицин обладает уникальным механизмом действия, ингибирующим синтез клеточной стенки (Watanakunakorn, 1984), можно предположить, что фаговая инфекция была негативно влияет влияние ванкомицина на клеточную стенку бактерий.Действие даптомицина, разрушающее структуру мембраны бактериальной клетки, по-видимому, в меньшей степени влияет на действие фага. Как показали также Дикки и Перро, одновременное применение фага и даптомицина при 10-кратной МИК позволяло фагу расти, тогда как большинство антибиотиков, испытанных в их исследовании при 10-кратной МИК, либо предотвращали рост фага (ципрофлоксацин, ванкомицин и тетрациклин), либо приводили к значительному снижению плотности фага. (гентамицин, эритромицин и линезолид) (Dickey and Perrot, 2018).

    Как правило, ванкомицин рекомендуется для лечения инфекций, связанных с имплантатами MRSA (Paiva and Eggimann, 2017), однако сообщалось о высокой частоте неэффективности лечения ванкомицином при инфекциях, вызванных чувствительными к ванкомицину MRSA (Dombrowski and Winston, 2008; Abdelhady et al. ., 2013). Это наблюдение коррелирует с нашими выводами, показывающими неэффективность лечения биопленок клинических штаммов ванкомицином отдельно или в сочетании с Sb-1. Низкая эффективность ванкомицина против стафилококковых биопленок может быть связана с уменьшением проникновения биопленки, снижением концентрации свободного ванкомицина, секвестрированного S. aureus на слоях пептидогликана, или стимуляцией образования биопленки низкими концентрациями ванкомицина (Broussou et al. ., 2018). И наоборот, даптомицин продемонстрировал более высокую эффективность против инфекций костей и суставов, вызванных MRSA (Chang et al., 2017; Теллес и др., 2019). Устойчивый синергетический эффект, наблюдаемый при комбинации Sb-1/даптомицин против всех исследованных в нашем исследовании устойчивых к рифампину штаммов MRSA, наряду с хорошими свойствами проникновения в биопленку (Ozturk et al., 2016) и активностью in vitro против стационарных бактерий внутри биопленки (Smith et al., 2009), делает даптомицин перспективным кандидатом для комбинаторной терапии.

    Другим многообещающим терапевтическим подходом, основанным на наших результатах, была обнаружена комбинация Sb-1 с флуклоксациллином для эрадикации устойчивых к рифампину штаммов MSSA, где наблюдалось значительное снижение значений MBEC, и только MBEC phage /MBEC . коэффициенты от 0.003, можно было наблюдать после поэтапного введения фага-антибиотика в отношении 67% штаммов. Анализ продукции бета-лактамазы типа А штаммами MSSA, ответственными за гидролиз цефазолина (Nannini et al., 2009), может пролить свет на более низкую антибиопленочную эффективность цефазолина по сравнению с флуклоксациллином.

    Низкие соотношения MBEC phage /MBEC отдельно (в диапазоне от 0,003 до 0,06) также наблюдались при ступенчатом введении Sb-1 с фосфомицином. Было показано, что фосфомицин действует синергически с другими антибиотиками против биопленок различных видов бактерий, включая MRSA, отчасти, вероятно, из-за его бактерицидной активности широкого спектра действия (Chai et al., 2016; Ван Л. и др., 2019). Кроме того, благоприятные характеристики, связанные с фосфомицином, включают способность разрушать биопленки и повышать проницаемость других противомикробных препаратов, а также предполагаемый иммуномодулирующий эффект (Mihailescu et al., 2014).

    Предыдущие исследования выявили синергетический эффект при сочетании фага с антибиотиком, к которому был устойчив штамм бактерий (Liu et al., 2020). Однако в нашем исследовании применение Sb-1 в комбинации с рифампицином против биопленок штаммов RRSA, а также комбинаций Sb-1/фосфомицин и Sb-1/гентамицин против MRSA3 и MRSA ATCC 43300 соответственно не выявило улучшенный антибиопленочный эффект.

    Пытаясь сделать выводы или сделать клиническую экстраполяцию, важно учитывать небольшое количество протестированных штаммов в нашем исследовании. Мы стремились предоставить первые оригинальные данные о комбинированном эффекте Sb-1 и различных антибиотиков для уничтожения биопленок RRSA in vitro. В нашей работе подчеркивается, что результаты, полученные при тестировании штаммов ATCC, могут отличаться от результатов клинических изолятов, а также среди различных штаммов, что означает, что выбор подходящей комбинированной терапии фагами и антибиотиками будет в значительной степени зависеть от штамма, вызывающего инфекцию, а также от специфическая антибиопленочная эффективность фага больше, чем его литический спектр.Более того, имеются убедительные доказательства того, что многие антибиотики могут влиять на инфекционную активность фага, особенно в концентрациях, превышающих измеренные минимальные ингибирующие концентрации, и, таким образом, на первичные фармакодинамические свойства фага. Следовательно, необходимы дальнейшие доклинические и клинические исследования для поддержки разработки комбинированной терапии фагами/антибиотиками с использованием конкретных изолятов. Факторы, указывающие на более персонализированный подход к успешному лечению антибиотикорезистентных инфекций, связанных с имплантатами.

    Заявление о доступности данных

    Оригинальные материалы, представленные в исследовании, включены в статью/дополнительный материал, дальнейшие запросы можно направлять соответствующему автору.

    Вклад авторов

    LW и TT выполнили эксперименты с участием MG. MG, LW и TT проанализировали данные. MG и TT подготовили рукопись при участии LW и AT. Все авторы задумали и разработали эксперименты, а также отредактировали и одобрили окончательную версию этой рукописи.

    Конфликт интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Финансирование

    Эта работа финансировалась Фондом PRO-IMPLANT (https://www.pro-implant-foundation.org), некоммерческой организацией, поддерживающей исследования, образование, глобальные сети и уход за пациентами с костно-суставными или инфекция, связанная с имплантатом.

    Благодарности

    Благодарим доктора мед. Tassilo Kruis из клинической микробиологии (Labor Berlin) за сбор и подготовку устойчивых к рифампину изолятов Staphylococcus aureus . Мы признательны за поддержку со стороны Немецкого исследовательского фонда (DFG) и Фонда публикаций открытого доступа Charité — Universitätsmedizin Berlin.

    Дополнительный материал

    Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2020.602057/full#supplementary-material

    Каталожные номера

    Abdelhady, W., Bayer, A.S., Seidl, K., Nast, C.C., Kiedrowski, M.R., Horswill, A.R., et al. (2013). Сниженная чувствительность к ванкомицину в модели биопленки, связанной с катетером in vitro, коррелирует с плохими терапевтическими результатами при экспериментальном эндокардите, вызванном устойчивым к метициллину Staphylococcus aureus . Антимикроб. Агенты Чемотер. 57, 1447–1454. doi: 10.1128/aac.02073-12

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Akturk, E., Oliveira, H., Santos, S.B., Costa, S., Kuyumcu, S., Melo, L.D.R., et al. (2019). Синергическое действие фага и антибиотиков: параметры для повышения эффективности уничтожения моно- и двухвидовых биопленок. Антибиотики 8:103. doi: 10.3390/антибиотики8030103

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Азам, А. Х., и Танджи, Ю. (2019). Особенности фагов Staphylococcus aureus и их возможное применение в фаготерапии. Заяв. микробиол. Биотехнолог. 103, 4279–4289. doi: 10.1007/s00253-019-09810-2

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Бауэр, Дж., Сиала, В., Тулкенс, П.М., и Ван Бамбеке, Ф. (2013). Комбинированная фармакодинамическая количественная и качественная модель показывает мощную активность даптомицина и делафлоксацина против биопленок Staphylococcus aureus . Антимикроб. Агенты Чемотер. 57, 2726–2737. doi: 10.1128/aac.00181-13

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Бруссу, Д.К., Лакруа, М.З., Тутэн, П.-Л., Вёрле, Ф., Эль Гарш, Ф., Буске-Мелу, А., и др. (2018). Дифференциальная активность комбинации ванкомицина и амикацина в отношении планктонных и биопленочных бактерий Staphylococcus aureus в модели инфекции полых волокон. Фронт. микробиол. 9:572. doi: 10.3389/fmicb.2018.00572

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Чай, Д., Лю, X., Ван, Р., Бай, Ю., и Цай, Ю. (2016). Эффективность линезолида и фосфомицина при инфекции биопленки, связанной с катетером, вызванной устойчивым к метициллину Staphylococcus aureus . Биомед Рез. Междунар. 2016:6413982. дои: 10.1155/2016/6413982

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Чанг, Ю.-Дж., Ли, М.С., Ли, К.-Х., Линь, П.-К., и Куо, Ф.-К. (2017). Лечение даптомицином больных резистентной стафилококковой перипротезной инфекцией суставов. BMC Заражение. Дис. 17:736. doi: 10.1186/s12879-017-2842-6

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Чаудри, В. Н., Консепсьон-Асеведо, Дж., Парк Т., Андлеб С., Булл Дж. Дж. и Левин Б. Р. (2017). Синергизм и порядок действия антибиотиков и фагов при уничтожении Pseudomonas aeruginosa биопленок. PLoS One 12:e0168615. doi: 10.1371/journal.pone.0168615

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Croes, S., Beisser, P.S., Neef, C., Bruggeman, C.A., и Stobberingh, E.E. (2010). Непредсказуемые эффекты рифампина в качестве вспомогательного средства при элиминации чувствительных и устойчивых к рифампину штаммов Staphylococcus aureus , выращенных в биопленках. Антимикроб. Агенты Чемотер. 54, 3907–3912. doi: 10.1128/aac.01811-09

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Дэвидсон, Д. Дж., Спратт, Д., и Лиддл, А. Д. (2019). Имплантационные материалы и протезирование суставов: битва с биопленкой. EFORT Open Rev. 4, 633–639. дои: 10.1302/2058-5241.4.180095

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Дики, Дж., и Перро, В. (2018). Дополнительное лечение фагами повышает эффективность низких концентраций антибиотиков против биопленок Staphylococcus aureus in vitro . BioRxiv [препринт]. дои: 10.1101/358879

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Домбровски, Дж. К., и Уинстон, Л. Г. (2008). Клинические неудачи соответственно леченных метициллин-резистентных инфекций Staphylococcus aureus . Дж. Заражение. 57, 110–115. doi: 10.1016/j.jinf.2008.04.003

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Гловацка-Рутковска, А., Гоздек, А., Эмпель, Й., Гавор, Й., Жухневич, К., Козинская А. и др. (2019). Способность литического стафилококкового подовируса vB_SauP_phiAGO1.3 сосуществовать в равновесии со своим хозяином облегчает отбор мутантов-хозяев с ослабленной вирулентностью, но не исключает антистафилококковой активности фага в модели нематодной инфекции. Фронт. микробиол. 9:3227. doi: 10.3389/fmicb.2018.03227

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Гонсалес Морено, М., Ван, Л., Де Маси, М., Винклер, Т., Трампус, А., и Ди Лука, М. (2019). Антимикробная активность in vitro в отношении биопленок Abiotrophia дефекта и Granulicatella elegans . J. Антимикроб. Чемотер. 74, 2261–2268. doi: 10.1093/jac/dkz174

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Moser, C., Bassi, G.L., Coenye, T., Donelli, G., et al. (2015). Руководство ESCMID по диагностике и лечению биопленочных инфекций, 2014 г. Clin. микробиол.Заразить. 21(Прил.1), С1–С25.

    Академия Google

    Хан Мирзаи, М., и Нильссон, А.С. (2015). Выделение фагов для фаговой терапии: сравнение точечных тестов и эффективности посевных анализов для определения диапазона хозяев и эффективности. PLoS One 10:e0118557. doi: 10.1371/journal.pone.0118557

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Кумаран, Д., Таха, М., Йи, К., Рамирес-Аркос, С., Диалло, Дж. С., Карли, А., и другие. (2018). Имеет ли значение порядок лечения? Изучение способности бактериофага усиливать антибиотическую активность против биопленок Staphylococcus aureus . Фронт. микробиол. 9:127. doi: 10.3389/fmicb.2018.00127

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Квачадзе Л., Баларджишвили Н., Месхи Т., Тевдорадзе Э., Схиртладзе Н., Патаридзе Т. и др. (2011). Оценка литической активности стафилококкового бактериофага Sb-1 в отношении свежевыделенных клинических возбудителей. Микроб. Биотехнолог. 4, 643–650. doi: 10.1111/j.1751-7915.2011.00259.x

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Liu, C.G., Green, S.I., Min, L., Clark, J.R., Salazar, K.C., Terwilliger, A.L., et al. (2020). Синергия фаг-антибиотик обусловлена ​​уникальным сочетанием антибактериального механизма действия и стехиометрии. BioRxiv [препринт]. дои: 10.1101/2020.02.27.967034

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Михайлеску, Р., Furustrand Tafin, U., Corvec, S., Oliva, A., Betrisey, B., Borens, O., et al. (2014). Высокая активность фосфомицина и рифампина в отношении метициллин-резистентной биопленки Staphylococcus aureus in vitro и в модели экспериментальной инфекции инородного тела. Антимикроб. Агенты Чемотер. 58, 2547–2553. doi: 10.1128/aac.02420-12

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Наннини, Э. К., Стрыевски, М. Э., Сингх, К. В., Бургонь, А., Руд, Т.Х., Кори Г.Р. и соавт. (2009). Эффект инокуляции цефазолином среди клинических изолятов метициллин-чувствительного Staphylococcus aureus : частота и возможная причина неэффективности лечения цефазолином. Антимикроб. Агенты Чемотер. 53, 3437–3441. doi: 10.1128/aac.00317-09

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Озтюрк Б., Гюнай Н., Эртугрул Б. М. и Сакарья С. (2016). Влияние ванкомицина, даптомицина и тигециклина на коагулазонегативную биопленку Staphylococcus и жизнеспособность бактерий в биопленке: модель биопленки in vitro. Кан. Дж. Микробиол. 62, 735–743. doi: 10.1139/cjm-2015-0855

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Пайва, Дж. А., и Эггиманн, П. (2017). Лечение тяжелых инфекций MRSA: современная практика и дальнейшее развитие. Интенсивная терапия Мед. 43, 233–236. doi: 10.1007/s00134-016-4572-4

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Райан, Э. М., Алкаварик, М. Ю., Доннелли, Р. Ф., и Гилмор, Б.Ф. (2012). Синергические комбинации фаг-антибиотик для контроля биопленок Escherichia coli in vitro. ФЭМС Иммунол. Мед. микробиол. 65, 395–398. doi: 10.1111/j.1574-695x.2012.00977.x

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Сенди, П., Грабер, П., и Циммерли, В. (2008). Факторы риска, связанные с острыми инфекциями протезов тазобедренных суставов, и результаты лечения схемами на основе рифампина. Акта Ортоп. 79, 454–455.дои: 10.1080/17453670710015418

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Сенди, П., и Циммерли, В. (2017). Применение рифампина при стафилококковых инфекциях, связанных с ортопедическими устройствами. клин. микробиол. Заразить. 23, 349–350. doi: 10.1016/j.cmi.2016.10.002

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Smith, K., Perez, A., Ramage, G., Gemmell, C.G., and Lang, S. (2009). Сравнение выживаемости клеток, связанных с биопленками, после воздействия in vitro на биопленки, устойчивые к метициллину Staphylococcus aureus , антибиотикам клиндамицину, даптомицину, линезолиду, тигециклину и ванкомицину. Междунар. Дж. Антимикроб. Агенты 33, 374–378. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2008.08.029

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Сулаквелидзе А., Алавидзе З. и Моррис Дж. Г. (2001). Бактериофаговая терапия. Антимикроб. Агенты Чемотер. 45, 649–659.

    Академия Google

    Теллес, Дж. П., Чеслински, Дж., и Туон, Ф. Ф. (2019). Даптомицин для инфекций костей и суставов и инфекций суставов протезов: систематический обзор. Браз. Дж. Заразить. Дис. 23, 191–196. doi: 10.1016/j.bjid.2019.05.006

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Тхилаишвили, Т., Ломбарди, Л., Клатт, А.Б., Трампуз, А., и Ди Лука, М. (2018). Бактериофаг Sb-1 усиливает антибиотическую активность в отношении биопленки, разрушает экзополисахаридный матрикс и нацеливается на персистеров Staphylococcus aureus . Междунар. Дж. Антимикроб. Агенты 52, 842–853. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2018.09.006

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Тонг С.Ю., Дэвис Дж.С., Эйхенбергер Э., Холланд Т.Л. и Фаулер В.Г. мл. (2015). Инфекции Staphylococcus aureus : эпидемиология, патофизиология, клинические проявления и лечение. клин. микробиол. Ред. 28, 603–661. doi: 10.1128/cmr.00134-14

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Виазис С., Ахтар М., Фейртаг Дж., Браббан А.Д. и Диес-Гонсалес Ф. (2011). Выделение и характеристика литических бактериофагов против энтерогеморрагической Escherichia coli . J. Appl. микробиол. 110, 1323–1331. doi: 10.1111/j.1365-2672.2011.04989.x

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Ван, К., Фанг, Р., Чжоу, Б., Тянь, X., Чжан, X., Чжэн, X., и др. (2019). Эволюция механизмов резистентности и биологических характеристик устойчивых к рифампицину штаммов Staphylococcus aureus , отобранных in vitro. ВМС микробиол. 19:220. doi: 10.1186/s12866-019-1573-9

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Ван, Л., Ди Лука, М., Тхилаишвили, Т., Трампуз, А., и Гонсалес Морено, М. (2019). Синергическая активность фосфомицина, ципрофлоксацина и гентамицина в отношении биопленок Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa . Фронт. микробиол. 10:2522. doi: 10.3389/fmicb.2019.02522

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Ван, З., Zheng, P., Ji, W., Fu, Q., Wang, H., Yan, Y., et al. (2016). SLPW: вирулентный бактериофаг, нацеленный на устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus in vitro и in vivo . Фронт. микробиол. 7:934. doi: 10.3389/fmicb.2016.00934

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Ватанакунакорн, К. (1984). Механизм действия и активность ванкомицина in vitro. J. Антимикроб. Чемотер. 14, 7–18. doi: 10.1093/jac/14.suppl_d.7

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Циммерли, В., и Сенди, П. (2019). Роль рифампина в борьбе с инфекциями стафилококковой биопленки in vitro, на животных моделях и инфекциях, связанных с ортопедическими устройствами. Антимикроб. Агенты Чемотер. 63:e01746-18. doi: 10.1128/aac.01746-18

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Staphylococcus Phage — обзор

    I Стратегии действия стафилококковых фагов типа Twort для преодоления систем рестрикции хозяина

    Основной защитой от вторжения ДНК являются системы рестрикции-модификации (RM) (Murray, 2000).Они также являются основным барьером, ограничивающим горизонтальный перенос генов между стафилококковыми штаммами разных клональных линий, а также распространение стафилококковых фагов (Lindsay, 2010; Novick, 1990; Waldron and Lindsay, 2006; Zueva et al. ., 1990). Соответственно, распределение профагов значительно различается между штаммами доминирующих клональных линий человеческих штаммов S. aureus , отличающихся своими генами специфичности RM (Goerke et al. ., 2009; Waldron and Lindsay, 2006).Было высказано предположение, что инактивация системы РМ ответственна за повышенную восприимчивость некоторых мутагенизированных изолятов S. aureus к лизису бактериофагов (Iordanescu and Surdeanu, 1976; Stobberingh and Winkler, 1977). Кроме того, клетки S. aureus могли приобретать устойчивость ко всем 23 фагам международного базового набора S. aureus при лизогенизации фагом ϕ42, который кодирует собственную систему RM, Sau42I (Dempsey et al ., 2005). .Таким образом, эффективная защита от рестрикции должна быть существенной детерминантой поливалентности стафилококковых Twort-подобных фагов.

    Бактериофаги выработали различные стратегии, чтобы избежать ограничений хозяина (обзор Labrie et al ., 2010). В прототипе Spounavirinae , репрезентативном SPO1, тимин заменен гидроксиметилурацилом (HMU), чтобы избежать атак эндонуклеаз рестрикции хозяина, которые распознают сайты, содержащие первый. Стафилококковые Twort-подобные фаги не содержат HMU в своей ДНК (O’Flaherty et al ., 2004). Одна из их стратегий преодоления активности R-M хозяина заключается в том, чтобы избегать распознаваемых хозяином сайтов рестрикции в ДНК. Геномы этих фагов не содержат последовательностей GATC, которые являются сайтами узнавания S . aureus Sau3AI эндонуклеаза рестрикции (O’Flaherty et al. ., 2004; Sussenbach et al. ., 1976; данные не показаны). Кроме того, каждый из них содержит только одну последовательность распознавания второй рестриктазы S. aureus известной специфичности, Sau96I (GGNCC; Sussenbach et al ., 1978; Szilak и др. , 1990).

    Защитная эффективность систем Р-М прямо пропорциональна количеству сайтов узнавания во вторгающейся ДНК (Wilson and Murray, 1991). Таким образом, отсутствие или недостаток определенных тетра- или пентануклеотидов в ДНК крупных фагов может служить ориентиром при открытии новых специфичностей рестрикционных ферментов у бактерий, являющихся их хозяевами. Следующие дополнительные последовательности из 4 или 5 п.н. отсутствуют или присутствуют только в единственной копии в ДНК стафилококковых Twort-подобных фагов: CGCG, GGCC, CGWCG, GCWGC, CCGG и CCSGG.Один из них, CGCG — сайт распознавания B . subtilis эндонуклеаза BsuE (Gaido et al ., 1988) – также отсутствует в геноме фага Bacillus SPO1. Возможно, стафилококковые клетки кодируют изошизомер BsuE. Специфика по крайней мере нескольких систем S. aureus R-M все еще требует идентификации (Dempsey et al ., 2005; Waldron and Lindsay, 2006).

    Малочисленность определенных сайтов рестрикции в ДНК не может быть единственной стратегией защиты стафилококковых фагов типа Twort от систем R-M их хозяев.Слишком большое количество сайтов должно отсутствовать в геномах этих фагов, чтобы избежать различных систем R-M типа I, присутствующих в S . aureus различных клональных линий, а также системы различных типов, которые кодируются стафилококковым мобилом (Dempsey et al ., 2005; Iordanescu and Surdeanu, 1976; Noto et al ., 2008; Sjöström et al. ., 1978; Tsuru et al. ., 2006; Waldron and Lindsay, 2006; Veiga and Pinho, 2009).Соответственно, последовательность CTYRAG, которая распознается изошизомером SmlI, обнаруженным в некоторых стафилококковых штаммах (Godany et al. ., 2004), широко распространена в ДНК стафилококковых Twort-подобных фагов.

    Несмотря на удивительно широкий диапазон штаммовой специфичности S . золотистый / S . epidermidis Twort-подобные фаги, определенные S . золотистый / S . Штаммы epidermidis в больших коллекциях штаммов остаются устойчивыми к заражению определенными фагами этой группы (O’Flaherty et al ., 2005б; Pantucek и др. , 1998). В большинстве случаев за наблюдаемую резистентность ответственны системы Р-М. Kelly и соавторы (2011) изучили 29 штаммов, устойчивых к фагу К. Они смешали культуру каждого устойчивого штамма с супернатантом культуры того же штамма, который подвергался воздействию фага К в течение времени, обычно достаточного для лизиса клеток. В случае 24 изначально устойчивых штаммов повторение этой процедуры от двух до пяти раз приводило к очистке бактериальной культуры и высвобождению фагов-потомков, способных эффективно размножаться в клетках таких штаммов.Подобные процедуры «адаптации» Twort-подобных фагов к изначально резистентным бактериальным хозяевам широко использовались в нескольких лабораториях (см., например, O’Flaherty et al. ., 2005b; Pantucek et al. ., 1998; Ralston and Krueger, 1954).

    Хотя системы R-M редко обеспечивают полную защиту штаммов S. aureus / S. epidermidis от инфекции соответствующими Twort-подобными фагами, они могут серьезно ограничивать эффективность инфекции определенных штаммов, которые отличаются от штамма, размножающегося фагом.Улатовска и его коллеги (в процессе подготовки) изучили инфекционную эффективность 74 клинических S . aureus штаммов 11 типов PFGE и нескольких подтипов с помощью фага A5W, размноженных в штамме S. aureus PS80. Только в случае 16 штаммов эффективность посева A5W была такой же, как и в случае штамма для размножения фага. В других случаях эффективность покрытия была на два-семь порядков ниже. Инфицирование клеток первой группы штаммов А5W в жидких культурах (у M.О.И. > 1) привело к очистке культуры в течение первого часа. Жидкие культуры некоторых штаммов второй группы также полностью очищались при воздействии A5W при аналогичном M.O.I, но со значительной задержкой. По-видимому, фаги, высвобождаемые из части первоначально инфицированных клеток, приобретали способность эффективно инфицировать оставшиеся клетки в культуре, приобретая характер метилирования их ДНК. Что делает эти исходные фракции клеток восприимчивыми к фаговой инфекции, несмотря на чужеродный паттерн метилирования заражающей ДНК фага, неясно.Одним из факторов может быть негерметичность клеточных систем RM, вызванная вариациями их активности или экспрессии на разных стадиях клеточного цикла или роста популяции, как это было обнаружено аналогично в случае Bacillus staerothermophilus RM системы BstVI (Gonzalez et al ). ., 1994). Кроме того, стафилококковые Twort-подобные фаги должны кодировать эффективные антирестрикционные механизмы. Описано множество разнообразных антирестрикционных систем других фагов. Фаговые ферменты, которые инактивируют эндонуклеазы рестрикции хозяина, модулируют функцию или экспрессию ассоциированных метилтрансфераз или метилируют ДНК фага при инфицировании, участвуют в их функционировании (Atanasiu et al ., 2001; Дэвисон и Брюнель, 1979 г.; Iida и др. ., 1987; Łobocka и др. ., 2004; МакКоркодейл и Уорнер, 1988). В случае некоторых фагов, например Р1, антирестрикционные белки вводятся в клетки при заражении вместе с фаговой ДНК. Кроме того, активность рекомбинационных ферментов или фаговых белков, кодируемых фагом, которые усиливают рекомбинационные функции хозяина, могут при множественной инфекции восстанавливать разрушенную ДНК фага путем рекомбинационной репарации. До сих пор среди предсказанных белков стафилококковых Twort-подобных фагов не было идентифицировано гомологов известных антирестрикционных белков.Гены этих фагов, кодирующие антирестрикционные функции, еще предстоит обнаружить с помощью функциональных исследований.

    Роль hlb-конвертирующих бактериофагов в адаптации хозяина Staphylococcus aureus – FullText – Microbial Physiology 2021, Vol. 31, № 2

    Являясь условно-патогенным микроорганизмом человека и животных, Staphylococcus aureus бессимптомно колонизирует носовую полость, но также является ведущей причиной опасных для жизни острых и хронических инфекций. Эволюция S.aureus , возникающий в результате краткосрочной и долгосрочной адаптации к различным хозяевам, тесно связан с мобильными генетическими элементами . Штаммы S. aureus могут нести до четырех умеренных фагов, многие из которых обладают дополнительными генами, кодирующими стафилококковые факторы вирулентности. Было показано, что более 90% назальных изолятов человека S. aureus несут фаги Sa3int, тогда как инвазивные изоляты S. aureus , как правило, теряют эти фаги. Фаги Sa3int интегрируются как профаги в бактериальный ген hlb , нарушая экспрессию сфингомиелиназы Hlb, важного фактора вирулентности при специфических условиях инфекции.Факторы вирулентности, кодируемые генами, переносимыми фагами Sa3int, включают стафилокиназу, энтеротоксины, белок, ингибирующий хемотаксис, и стафилококковый ингибитор комплемента, все из которых высоко специфичны для человека и, вероятно, необходимы для выживания бактерий в организме человека-хозяина. Передача S. aureus от людей к животным сильно коррелирует с потерей фагов Sa3int, тогда как фаги восстанавливаются после передачи штамма от животных к человеку. Т.о., как вставка, так и вырезание профагов могут давать преимущество в приспособленности этой бактерии . Также появляется все больше доказательств того, что фаги Sa3int могут осуществлять «активную лизогению», процесс, во время которого профаги временно вырезаются из хромосомы без образования интактных фаговых частиц. Молекулярные механизмы, контролирующие своеобразный жизненный цикл фагов Sa3int, остаются во многом неясными. Тем не менее, их регуляция, вероятно, точно настроена, чтобы гарантировать выживание бактерий в разных хозяевах.

    © 2021 Автор(ы) Опубликовано S. Karger AG, Базель

    Введение

    Staphylococcus aureus является основным оппортунистическим патогеном человека и животных, который бессимптомно колонизирует слизистую оболочку носа, но также является основной причиной жизни. угрожающие острые и хронические инфекции [Balasubramanian et al., 2017; Тернер и др., 2019]. На основании анализа мультилокусного типирования последовательностей (MLST) штамма S. aureus были отнесены к различным эволюционно родственным клональным комплексам (CC) [Feil et al., 2003]. Большинство штаммов несут в своем геноме до четырех профагов, многие из которых несут дополнительные гены, кодирующие стафилококковые факторы вирулентности [Xia and Wolz, 2014; Ингмер и др., 2019b]. Дополнительные гены, присутствующие в геномах профагов, не имеют очевидной фаговой функции, но могут действовать как приспособленные факторы для лизогенных бактерий.Все известные умеренные стафилококковые фаги принадлежат к семейству Siphoviridae . Геномы сифовирусов обычно организованы в шесть функциональных модулей: лизогения, репликация ДНК, упаковка, головка, хвост и лизис. Эволюция фаговых линий обусловлена ​​латеральным переносом взаимозаменяемых генетических элементов (модулей), состоящих из функционально родственных генов [Kwan et al., 2005; Гёрке и др., 2009 г.; Каханкова и др., 2010; Дегорайн и Ван Мелдерен, 2012 г.; Ингмер и др., 2019б; Оливейра и др., 2019]. S. aureus -инфицирующие сифовирусы были классифицированы в соответствии с полиморфизмами гена интегразы ( int ) [Goerke et al., 2009; Каханкова и др., 2010; Дегорейн и Ван Мелдерен, 2012]. Тип int определяет хромосомную интеграцию в родственных сайтах attB и тесно связан с содержанием генов вирулентности профага [Goerke et al., 2009]. Фаги Sa3int были впервые описаны как фаги с тройным преобразованием и на сегодняшний день являются наиболее распространенными S.aureus [van Wamel et al., 2006; Гёрке и др., 2009 г.; Веркаик и др., 2011]. Было обнаружено, что до 96% назальных изолятов человека несут фаги Sa3int, интегрированные в локус hlb , который кодирует β-гемолизин (Hlb), также называемый β-токсином. Эти фаги несут гены, кодирующие специфические для человека факторы уклонения от иммунного ответа [van Wamel et al., 2006] и другие потенциальные факторы вирулентности [Ingmer et al., 2019b]. В настоящее время имеются убедительные доказательства того, что фаги Sa3int играют важную роль в адаптации S.aureus человеку-хозяину [Sung et al., 2008; Ингмер и др., 2019a; Буйе и др., 2020; Матушевская и др., 2020]. Передача S. aureus от человека к домашнему скоту сильно коррелирует с потерей фагов Sa3int, тогда как эти фаги восстанавливаются при передаче штамма от животных к человеку. Утрата фагов Sa3int связана с восстановлением гена hlb и последующим синтезом HLB, что важно при специфических инфекциях. В этом обзоре мы сначала обобщаем последние данные о функции дополнительных факторов, кодируемых фагом, и инактивированного фагом Hlb.Затем мы соберем эпидемиологические данные, подтверждающие преобладающую роль переключателей жизненного цикла Sa3int в выживании и адаптации бактерий к различным инфекционным условиям.

    Phage-Encoded Accessory Genes

    Van Wamel et al. [2006] впервые описали так называемый кластер уклонения от иммунного ответа (IEC), включающий гены scn , chp , sak и sea/sep. , которые кодируют ингибитор стафилококкового комплемента (SCIN), ингибирующий хемотаксис белок S.aureus (CHIPS), стафилокиназу (SAK) и стафилококковый энтеротоксин A или P (SEA или SEP) соответственно. Было идентифицировано семь вариантов IEC, которые несут различные комбинации scn, chp , sak или sea (или sep ), всегда в одной и той же ориентации 5′-к-3′ рядом с модулем лизиса на 3′-конец фагов Sa3int. Scn присутствует в каждом типе IEC, тогда как sak , chp и sea/sep наблюдаются только в некоторых комбинациях IEC [van Wamel et al., 2006] (показаны на рис. 1). Функции SCIN, CHIPS, SAK и SEA очень специфичны для человека, что подтверждает гипотезу о том, что этот кластер развился для поддержки адаптации бактерий к человеку-хозяину. Кроме того, секвенирование различных изолятов S. aureus и функциональный анализ привели к идентификации нескольких дополнительных дополнительных генов, переносимых фагами Sa3int, некоторые из которых расположены на противоположном 5′-конце фага вблизи int . (показано на рис.1).

    Рис. 1.

    Схематическое изображение фагов Sa3int. Генетическая организация репрезентативного фага Ф13 (вверху) штамма 8325. Аннотации основаны на Iandolo et al. [2002] и отобрано вручную. Увеличенный вид (внизу) кодируемых фагом дополнительных генов, расположенных в прототипе S . aureus , штаммы 8325, USA300, Newman, MW2 и N315. Оранжевым прямоугольником отмечены дополнительные гены, расположенные вблизи int . Зеленые и синие прямоугольники представляют гены кластера уклонения от иммунного ответа (IEC) [van Wamel et al., 2006] и недавно открытая система токсин-антитоксин sprG1/F1.

    Гены вирулентности, кодируемые фагом, интегрируются в регуляторную систему бактериального хозяина и модулируются способом, удивительно сходным с факторами вирулентности, кодируемыми бактериальными хромосомами (обзор см. в Ingmer et al. [2019b]). Альтернативный сигма-фактор B, двухкомпонентная система регуляции, saeRS , и в меньшей степени система определения кворума, agr , участвуют в регуляции eta, pvl, scn, или chp .Однако экспрессия этих факторов вирулентности также тесно связана с жизненным циклом фага. В фаг-индуцирующих условиях увеличивается транскрипция факторов вирулентности [Sumby and Waldor, 2003; Гёрке и др., 2006а]. Частично это происходит из-за эффекта множественных копий, вызванного репликацией фага, но транскрипция также увеличивается за счет ко-транскрипции с дерепрессированными генами лизиса.

    В следующем разделе мы суммируем основные свойства вспомогательных генов, кодируемых Sa3int, в соответствии с их порядком в фаговом геноме (показано на рис.1). Примечательно, что в геномах Sa3int присутствует гораздо больше факторов, которые ждут дальнейшего анализа.

    Ингибитор комплемента стафилококка (SCIN)

    SCIN был впервые описан как секретируемый фагом белок с молекулярной массой 9,8 кДа, относящийся к новому классу ингибиторов конвертазы [Rooijakkers et al., 2005a] (для обзора см. Garcia et al. [ 2012]). SCIN способен блокировать классический и альтернативный пути активации комплемента. Эти пути пересекаются при превращении компонента комплемента С3 в его биоактивные фрагменты С3а и С3b.C3b, связанный с бактериальной поверхностью, может образовывать комплекс с циркулирующим фактором комплемента B. SCIN взаимодействует с комплексом C3bBb и нарушает нижестоящую функцию комплемента, захватывая конвертазу в стабильном, но неактивном состоянии [Rooijakkers et al., 2009]. SCIN также способствует образованию димеров конвертазы [Jongerius et al., 2010], что важно для уклонения S. aureus от иммунного ответа путем модулирования распознавания комплемента фагоцитарными рецепторами. SCIN обладает высокой специфичностью в отношении комплемента человека и не блокирует активацию комплемента в сыворотке других животных [Rooijakkers et al., 2005а]. Следует отметить, что несколько гомологов SCIN были идентифицированы в других местах генома [Rooijakkers et al., 2009]. Интересно, что EqSCIN был обнаружен в фагах изолятов S. aureus от лошадей, и было показано, что он специфически ингибирует С3-конвертазы лошадей [de Jong et al., 2018].

    Ингибирующий хемотаксис белок

    S. aureus (ЧИПС)

    Супернатанты S. aureus могут вызывать подавление специфических рецепторов иммунных клеток, участвующих в хемотаксисе [Veldkamp et al., 2000], процесс, который, как позже было показано, обусловлен секрецией 14,1-кДа белка, названного CHIPS [de Haas et al., 2004]. Хемотаксис представляет собой общий механизм, с помощью которого клетки движутся к хемоаттрактантам и используется для рекрутирования иммунных клеток в очаг бактериальной инфекции. Хемоаттрактанты эффективно связываются с высокоспецифичными рецепторами, такими как рецепторы формилированных пептидов (FPR) или C5aR, экспрессируемые на иммунных клетках. FPR реагируют на формилированный метионин или другие хемотаксические пептиды, полученные из бактерий [Bloes et al., 2015]. C5aR экспрессируется на нескольких типах лейкоцитов и распознает хемоаттрактант C5a. Примечательно, что CHIPS действует как мощный ингибитор этого хемотаксического ответа, специфически связываясь с FPR и C5aR [Postma et al., 2004], и его часто используют в качестве инструмента для специфического ингибирования этих путей. Исследование, оценивающее связывание меченых FITC CHIPS с изолированными нейтрофилами различных видов животных, выявило низкий уровень связывания CHIPS с нейтрофилами других тестируемых видов по сравнению с нейтрофилами человека [de Haas et al., 2004]. Таким образом, ЧИПЫ играют важную роль в способности S . aureus , чтобы обойти его распознавание иммунными клетками человека путем ингибирования опосредованного хемоаттрактантом рекрутирования нейтрофилов в очаг бактериальной инфекции.

    Стафилокиназа (SAK)

    Ранее было показано, что лизогенизация hlb бактериофагами серогруппы F коррелирует с активностью SAK [Winkler et al., 1965; Коулман и др., 1989]. SAK представляет собой секретируемый белок массой 15 кДа, который может ассоциироваться с поверхностью S . клеток aureus [Collen and Lijnen, 1994]. Для SAK описано несколько функций (для обзора см. Bokarewa et al. [2006]). Наиболее известным свойством SAK является его функция активатора плазминогена. Плазминоген является неактивным предшественником плазмина, сериновой протеазы широкого спектра действия, которая расщепляет фибрин и неколлагеновые белки внеклеточного матрикса. SAK способен превращать плазминоген в протеолитическую активную форму плазмина, способствуя образованию стехиометрического комплекса [Lijnen et al., 1991]. Генерация активного плазмина усиливается на поверхности S . aureus клеток [Mölkänen et al., 2002] и защищает от инактивации ингибиторами плазмина, которые обычно присутствуют в плазме человека [Silence et al., 1993]. Следовательно, бактерии, покрытые плазмином, подготовлены для деградации человеческого IgG или C3b [Rooijakkers et al., 2005b] или внеклеточного матрикса. Второй функцией, приписываемой SAK, является его способность связывать α-дефенсины, антимикробные пептиды человека, которые могут защищать хозяина от бактериальной инвазии [Bokarewa and Tarkowski, 2004].Взаимодействие САК с α-дефенсинами приводит к ингибированию их бактерицидной активности. Сайт связывания α-дефенсинов отличается от сайта, ответственного за связывание плазминогена [Jin et al., 2004].

    SAK специфически активирует плазминоген человека и не реагирует с плазминогеном мыши [Kwiecinski et al., 2015; Окада и др., 2000]. Чтобы преодолеть эту видовую специфичность, сравнивали трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий или природный плазминоген мыши, для анализа воздействия SAK во время бактериемии [Kwieciński et al., 2010]. Удивительно, но активация плазминогена человека с помощью SAK снижала тяжесть системной стафилококковой инфекции. Эта же модель впоследствии использовалась для анализа влияния САК на кожную инфекцию [Kwiecinski et al., 2013]. Хотя SAK не оказывал влияния на кожные инфекции у иммунокомпетентных мышей, у мышей с нейтропенией SAK способствовал возникновению кожных инфекций у гуманизированных мышей, экспрессирующих плазминоген, и увеличивал проникновение бактерий через кожные барьеры за счет активации плазминогена.Однако взаимодействие между SAK и плазминогеном не способствовало системной диссеминации, а вместо этого индуцировало вскрытие и дренирование абсцессов и снижение тяжести заболевания. В аналогичной гуманизированной модели инфекции, включающей аденовирусную экспрессию человеческого плазминогена, SAK-опосредованная активность плазмина увеличивала локальную инвазивность S. aureus , что приводило к более крупным поражениям с повреждением кожи, а также к снижению бактериального клиренса у хозяина [Peetermans et al. , 2014]. Тем не менее, SAK-индуцированный протеолиз, по-видимому, ограничивается ближайшим окружением места инфекции, где высокие концентрации фибрина и бактерий предотвращают инактивацию, но быстро нейтрализуются дальше от места абсцесса.Также было показано, что SAK ослабляет катетерные инфекции, связанные с биопленкой, на мышиной модели [Kwiecinski et al., 2015]. SAK-зависимая активация плазминзависимого протеолиза и фибринолиза приводит к нарушению архитектуры биопленки и отслоению бактерий. Таким образом, эти животные модели подтверждают идею о том, что бактерии in vivo покрыты комплексами SAK-плазмин. Хотя протеолитическая активность плазмина, по-видимому, способствует местной диссеминации, SAK не способствует системным инфекциям и даже, по-видимому, защищает от тяжелой бактериемии.

    Система токсин-антитоксин (SprG1/F1)

    Хотя она и не включена в первое описание IEC [van Wamel et al., 2006], система SprG1/F1 расположена в большинстве IEC [Pichon and Felden, 2005] . Записи для sprG/F в базе данных регуляторных РНК стафилококков (SRD) перечислены в таблице 1 и на рисунке 1 [Sassi et al., 2015]. Системы SprG/F были впервые обнаружены при скрининге sRNA и обозначены как малые островковые РНК патогенности (Sprs) от G1/F1 до G4/F4 [Pichon and Felden, 2005].Экспрессия sprG1/F1 была подтверждена для нескольких штаммов, включая N315 и Newman, но не для штамма NCTC8325 [Pinel-Marie et al., 2014]. Однако выравнивание последовательностей sprG1/F1 показало высокую консервативность этих систем среди геномов S. aureus , включая 8325 и MW2, с обнаружением лишь незначительных вариаций последовательностей. Антитоксин sprf1 перекрывается с sprg1 в антисмысловом направлении и не кодирует какой-либо пептид, а скорее функционирует как некодирующая цис-антисмысловая РНК, которая регулирует sprG1 .Также было показано, что мРНК sprF1 снижает синтез белка в условиях гиперосмотического стресса путем связывания с рибосомами. Это приводит к затуханию трансляции и усиленному образованию персистерных клеток [Pinel-Marie et al., 2021]. Два токсичных пептида транслируются из sprG , основной формы (SprG1 439 , 44 аминокислоты) и более короткой формы (SprG1 312 , внутренний стартовый кодон, 31 аминокислота). Пептиды SprG1 действуют как секретируемые порообразующие токсины, которые могут накапливаться на бактериальной мембране.Сверхэкспрессия sprG1 приводит к ингибированию роста с последующей гибелью клеток [Pinel-Marie et al., 2014]. Интересно, что пептиды SprG1 проявляют активность в отношении других видов бактерий, а более длинный пептид SprG1 439 также может лизировать эритроциты человека.

    Таблица 1.

    Дополнительные гены фагов Sa3int

    Стафилококковый энтеротоксин А (SEA)

    морской был одним из первых генов, описанных как фаговые, кодируемые в S. aureus [Bet 1].Стафилококковые энтеротоксины представляют собой суперантигены пирогенных токсинов, группу белков, которая также включает экзопротеины из Streptococcus pyogenes . Суперантигены взаимодействуют с молекулами MHC II, присутствующими на Т-клетках, а также с вариабельными частями рецепторов Т-клеток. Это взаимодействие приводит к массивной продукции цитокинов, таких как ИЛ-2 и ИФН-γ, в Т-клетках и ФНО-α и ИЛ-1β в макрофагах, что, вероятно, отвечает за типичный клинический исход синдрома токсического шока (СТШ) с высокой высокая температура.Стафилококковые энтеротоксины являются типичными суперантигенами, которые могут стимулировать Т-клетки. Название «энтеротоксин» происходит от их рвотных свойств, вызывающих рвоту и диарею при пероральном употреблении, что коррелирует с их ролью в стафилококковых пищевых отравлениях [Dinges et al., 2000]. Однако, поскольку было обнаружено несколько энтеротоксинов, не обладающих этими рвотными свойствами, в 2004 г. Комитетом по международной номенклатуре стафилококковых суперантигенов была предложена новая стандартизированная номенклатура вновь открытых энтеротоксинов, основанная на рвотных свойствах энтеротоксинов [Lina et al., 2004]. В этом предложении энтеротоксины обозначаются как энтеротоксины только в том случае, если рвотные свойства продемонстрированы на модели животных приматов. В противном случае, если это свойство отсутствует или эксперименты не проводятся, обнаруженный токсин следует назвать «стафилококковым энтеротоксиноподобным (SEl-) токсином» [Lina et al., 2004]. SEA представляет собой белок массой 27 кДа, относящийся к категории «настоящих» энтеротоксинов с суперантигенной и рвотной активностью [Bergdoll, 1988; Джонсон и журнал, 1988; Абрамсен и др., 1995]. Нетоксичные концентрации SEA индуцируют выработку интерлейкина-8 эпителиальными клетками носа, что указывает на то, что SEA может вызывать воспалительную реакцию в месте колонизации [O’Brien et al., 2006].

    Стафилококковый энтеротоксин (подобный) P (SEP)

    В некоторых штаммах (например, штамм N315, показанный на рис. 1) sep расположен в том же положении, что и sea в других фагах Sa3int. SEP и SEA обнаруживают 78% идентичность на уровне аминокислот, и SEP также обозначается как SEl-P на основании рекомендуемой номенклатуры [Thomas et al., 2007]. Рекомбинантный SEP показал рвотные свойства в тесте на домашней мускусной землеройке, хотя и в относительно высокой дозе [Omoe et al., 2005].SEP/SEI-P является классическим суперантигеном с высокой активностью стимуляции Т-клеток [Omoe et al., 2005].

    Дополнительные гены, расположенные в непосредственной близости от

    int

    Во многих фагах Sa3int разные ORF с неизвестной функцией расположены в лизогенном модуле между int и геном, кодирующим белок-репрессор фага. Предполагается, что эти гены не выполняют функцию поддержания самого профагового состояния, а скорее дают преимущество своей бактерии-хозяину.Некоторые из этих генов дивергентно транскрибируются с лизогенной транскрипционной единицы, что указывает на их автономную регуляцию. Например, ORF-C в Ф13 из штамма 8325 кодирует мембранный белок из 204 остатков, который дивергентно транскрибируется с лизогенного модуля (показан на рис. 1). Гомологи ORF-C присутствуют в нескольких других стафилококковых фагах (например, Ф12, ФЕТА, ФPVL, ФPV83 и ФSLT), которые относятся к разным группам Sa-int. На основании ее локализации было высказано предположение, что ORF-C может функционировать как эксцизионаза [Iandolo et al., 2002], хотя делеционный мутант для кодирующего гена не нарушается при вырезании (неопубликованные данные). Таким образом, функцию этого консервативного белка еще предстоит выяснить.

    MazF/PemK-подобный токсин

    SAUSA300_1971 расположен рядом с int в фаге Sa3int штамма USA300. Предсказанный белок (237 аминокислот) был аннотирован как PemK-подобный/MazF-подобный токсин системы токсин-антитоксин типа II. Этот же ген находится в том же положении у фагов Sa3int S.aureus штаммов JH9 и Jh2 (SaurJH9_2059 и SaurJh2_2096 соответственно) и в фаге Sa6int штамма Col (SACOL0319). MazF/PemK-подобные токсины принадлежат к семейству белков PF02452. Это семейство включает молекулу токсина типичных бактериальных систем токсин-антитоксин, включающую различные токсины, такие как MazF или PemK. Токсичность обычно ограничивается соседним антитоксином. Интересно, что предполагаемый антитоксин не обнаруживается рядом с кодируемым фагом гомологом MazF. Функция этого предполагаемого токсина еще предстоит изучить.

    Sek2 (MW1938) и seg2 (MW1937)

    Две ORF рядом с int фага Sa3int штамма MW2 были аннотированы как sek2 и seg2 . Предсказанные белки SEK2 и SEG2 демонстрируют >95% идентичность стафилококковому энтеротоксину K (SACOL0886) и энтеротоксину G (SACOL0887) S . aureus штамм КОЛ соответственно. Гены sek и seg находятся на острове патогенности в штаммах USA300 или COL, которые содержат дополнительные энтеротоксины.Кластер генов sek2/seg2 также присутствует в фаге Sa3int штамма MSSA476 [Sumby and Waldor, 2003]. Экспрессия обоих вариантов энтеротоксина увеличивается после индукции фага митомицином С и, вероятно, ко-транскрибируется с геном, кодирующим репрессор cI, который расположен выше обоих токсинов. Данные о рвотных свойствах энтеротоксина SEK/SEK2 отсутствуют. Однако для SEG рвотные свойства были показаны на модели животных приматов при введении в дозе 80 мг/кг веса животного [Munson et al., 1998].

    NWMN_1924 (гипотетический белок)

    В штамме Newman ORF (белок из 154 остатков) расположен рядом с int , который демонстрирует 100% идентичность с SAR2104 штамма MRSA252 и описан как предполагаемый липопротеин [Sibbald et al., 2006].

    Гликозилтрансфераза TarP

    TarP впервые был описан в фагах Sa3int штамма N315 и других клинических штаммах CC5. Однако tarP также переносится другими профагами (Sa1int, Sa3int, Sa7int, Sa9int и ΦUT1) и также присутствует в различных CC, включая LA-MRSA CC398 [Gerlach et al., 2018; Зибер и др., 2020 г.; Сюн и др., 2020]. TarP представляет собой альтернативную гликозилтрансферазу, которая изменяет характер гликозилирования стеночной тейхоевой кислоты S. aureus (WTA), катализируя присоединение GlcNAc в β-1,3-положении RboP [Gerlach et al., 2018]. Изменение WTA с помощью TarP не только влияет на способность некоторых бактериофагов распознавать S. aureus , но также нарушает опосредованное антителами иммунное распознавание. Однако TarP-опосредованная защита от антител против WTA, по-видимому, не влияет на передачу LA-MRSA CC398 в домашних условиях [Sieber et al., 2020].

    Птичьи hlb-конвертирующие профаги

    Видоспецифичные фаги Sa3int преобладают в домашней птице Изоляты S. aureus (обозначенные ФAvβ). У этих фагов отсутствует типичный IEC, но они скорее несут два птичьих специфических гена в одном и том же месте на 3′-конце ФAvβ. Первый ген (SAAV_2008) кодирует новую орнитинциклодеаминазу, на 38% идентичную ферменту из Bacillus cereus на уровне белка. Второй ген (SAAV_2009) имеет неизвестную функцию, но аннотирован как птичья специфическая протеаза, которая содержит домен CAAX с 27% идентичностью с мембраносвязанной протеазой, продуцируемой Lactobacillus plantarum .

    β-Гемолизин (Hlb)

    Hlb впервые был описан в 1935 г., когда Glenny and Stevens [1935] наблюдали эффект горяче-холодного гемолиза, в результате которого S. aureus культивировали при 37°C с последующим охлаждением до 4°C. в усиленном образце гемолиза на чашках с кровяным агаром. Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 37-кДа белок Hlb, была установлена ​​в 1989 г. [Projan et al., 1989]. Структурный анализ показал, что Hlb принадлежит к суперсемейству укладки ДНКаз I, которое включает сфингомиелиназы [Huseby et al., 2007]. Действительно, Hlb представляет собой фосфолипазу со специфичностью в отношении сфингомиелина для образования церамида и фосфохолина [Doery et al., 1963]. Hlb проявляет видозависимую гемолитическую активность, которая коррелирует с количеством сфингомиелина в эритроцитах, при этом эритроциты овец, коров и коз обладают высокой чувствительностью к токсину, эритроциты кролика и человека обладают промежуточной чувствительностью, а эритроциты мыши и собаки устойчивы [Bernheimer и др., 1974]. Однако Hlb способен эффективно воздействовать на эндотелиальные клетки человека [Herrera et al., 2017a], кератиноциты человека [Katayama et al., 2013] и моноциты [Walev et al., 1996; Хасеби и др., 2007]. Генерируемый Hlb церамид может действовать как вторичный мессенджер в эукариотических клетках [Li et al., 2019]. Кроме того, соотношение сфингомиелиназа/церамид регулирует интернализацию бактерий в клетку-хозяина, последующее высвобождение цитокинов, воспалительную реакцию и инициацию апоптоза клетки-хозяина. Таким образом, образование церамидов, вероятно, является причиной Hlb-зависимого ингибирования хемоаттрактанта IL-8, наблюдаемого в эндотелиальных клетках [Tajima et al., 2009; Эррера и др., 2017b]. Примечательно, что была описана вторая функция Hlb как биопленочной лигазы [Huseby et al., 2010]. Независимо от его сфингомиелиназной активности, Hlb образует ковалентные поперечные связи с самим собой в присутствии ДНК, продуцируя нерастворимый нуклеопротеиновый матрикс, который стимулирует образование биопленки. Было показано, что мутанты HLB, лишенные какой-либо из этих активностей, обладают пониженной способностью индуцировать образование вегетации при инфекционном эндокардите [Herrera et al., 2016].

    Роль Hlb как важного фактора вирулентности была продемонстрирована на нескольких животных моделях.Во-первых, было показано, что Hlb усугубляет инфекции молочных желез крупного рогатого скота [Cifrian et al., 1996] и кератит у кроликов [O’Callaghan et al., 1997]. В модели инфекции легких показано, что Hlb способствует усилению нейтрофильного воспаления и просачиванию белков сыворотки крови в ткань легких [Hayashida et al., 2009]. Повреждение легких, опосредованное нейтрофилами, было связано с Hlb-стимулированным эктодоменовым сбросом синдекана-1, основного протеогликана сульфата гепарина, присутствующего в эпителиальных клетках. В дополнение к его хорошо известной гемолитической активности в отношении эритроцитов было также показано, что Hlb играет важную роль в колонизации кожи, повреждая кератиноциты [Katayama et al., 2013].

    Фаги Sa3int и переходы от человека к животному

    S. aureus был обнаружен у целого ряда таксономически разнообразных животных, включая млекопитающих, рептилий, ракообразных и птиц [Haag et al., 2019b; Хитон и др., 2020 г.; Матушевская и др., 2020]. Некоторые CC S. aureus ограничены одной таксономической группой, что позволяет предположить, что отдельные популяции S. aureus сохраняются исключительно внутри данного вида [Haag et al., 2019b]. Другие СС распространены у нескольких видов, что указывает на передачу инфекции от человека к животным.Считается, что основным резервуаром S. aureus среди животных являются люди [Richardson et al., 2018; Матушевская и др., 2020]. Передача S. aureus между людьми и домашним скотом вызывает особую озабоченность, поскольку изоляты S. aureus от сельскохозяйственных животных часто устойчивы к антибиотикам [Wulf and Voss, 2008; Ричардсон и др., 2018]. Эпидемиологические исследования показали, что S. aureus много раз прыгали между видами, что приводило к динамическому приобретению и потере специфичных для хозяина адаптивных генов, которые обычно расположены на мобильных генетических элементах [McCarthy et al., 2011; Ричардсон и др., 2018].

    Фаги Sa3int представляют особый интерес. Они часто теряются при передаче от человека к разным животным. В нескольких случаях штамм, адаптированный к животным, передавался обратно людям, и эти штаммы, происходящие от домашнего скота, часто повторно приобретают фаги Sa3int, что подчеркивает их важную роль в колонизации человека (подробности см. ниже). Потеря Sa3int во многих штаммах животного происхождения и наблюдение, что Hlb всегда остается функциональным после удаления фага, указывают на то, что Hlb играет важную роль в патогенезе/колонизации животных.

    Свиньи

    С начала 2000-х годов сообщалось, что штаммы MRSA с типом последовательности ST398 колонизируют свиней и с тех пор распространились по всему миру, при этом эти штаммы также вызывают инфекции у людей, живущих в тесном контакте с домашним скотом [Bouiller et al., 2020 ]. Эти изоляты MRSA, ассоциированного с домашним скотом (LA-MRSA) CC398, являются потомками штамма MSSA человека, который приобрел устойчивость к метициллину и тетрациклину, но потерял фаг Sa3int [Price et al., 2012; Улеманн и др., 2012].Однако LA-MRSA CC398 может быть способен повторно адаптироваться к человеку-хозяину путем приобретения IEC-содержащего фага Sa3int [McCarthy et al., 2012; Куни и др., 2015; Зибер и др., 2020]. Было показано, что наличие IEC коррелирует с повышенной передачей от человека человеку и избыточным бременем болезни LA-MRSA [McCarthy et al., 2012; Зибер и др., 2020]. Кроме того, было отмечено, что доля вторичных случаев была значительно выше в домохозяйствах с положительной ИЭК (11/17), чем в отрицательных домохозяйствах (16/74) (PR 2.99, p = 0,0010) [Sieber et al., 2020]. Важность фагов Sa3int в вирулентности S. aureus по отношению к человеку также была более прямо продемонстрирована, поскольку присутствие Sa3int снижало фагоцитоз полиморфноядерными нейтрофилами человека, но не свиньи [Jung et al., 2017]. Сильный отбор фагов Sa3int во время колонизации человека еще более удивителен в свете открытия, что общий сайт интеграции attB, расположенный в пределах hlb , изменен в штаммах CC398.Таким образом, у этих штаммов Sa3int часто интегрируется в другом месте генома [Kraushaar et al., 2017; Тан и др., 2017 г.; van Alen et al., 2018], и место интеграции, по-видимому, влияет на стабильность профага Sa3int в линиях домашнего скота.

    В Азии распространенные штаммы LA-MRSA CC9 также могут вызывать тяжелые заболевания человека. Эти штаммы можно сгруппировать в две основные клады, где подтипы клады I содержат интактный ген hlb и лишены кластера IEC, в то время как укороченные гена hlb и IEC обнаружены в подтипах клады II [Chen et al., 2018]. Эти результаты свидетельствуют о том, что штамм CC9 с чрезвычайно высоким потенциалом вирулентности получил IEC-несущие фаги Sa3int после перехода от свиней к людям [Jin et al., 2020].

    В США существует разнообразная популяция LA-MRSA, включая организмы линии ST5 MRSA. Кроме того, ген hlb остается интактным в этих штаммах ST5 домашнего скота, что указывает на отсутствие фагов Sa3int. Напротив, распространенность фагов Sa3int в штаммах MRSA ST5 от людей, не контактировавших со свиньями, составила 90.4% [Hau et al., 2015].

    Домашняя птица

    Существует ограниченное количество генотипов S. aureus , ассоциированных с домашней птицей в различных географических регионах [Haag et al., 2019b; Матушевская и др., 2020]. Большинство этих изолятов принадлежат к одной линии CC (CC5), которая также является одной из наиболее успешных линий, связанных с человеком. Все изоляты домашней птицы тесно связаны между собой и произошли от одного хозяина от человека к птице, который произошел примерно 40 лет назад в Польше или рядом с ней [Lowder et al., 2009]. Клада ST5 домашней птицы претерпела генетическую диверсификацию по сравнению со штаммом-предшественником человека за счет приобретения новых мобильных генетических элементов из птичьего вспомогательного генофонда и за счет инактивации нескольких белков, важных для патогенеза заболеваний человека. В частности, этими изолятами был приобретен новый фаг Sa3int (ФAvβ), лишенный IEC. Вместо IEC этот фаг содержит гены, кодирующие новую орнитинциклодеаминазу и предполагаемую новую протеазу, которая, вероятно, участвует в адаптации к птицам [Lowder et al., 2009] (таблица 1). Фаг ФAvβ был обнаружен у всех 13 птичьих штаммов домашней птицы CC5, а также в других специфических для птиц линиях (CC385, ST1345 и ST1), что позволяет предположить, что частый горизонтальный перенос генов ФAvβ происходит между штаммами S. aureus . . Этот вывод был подкреплен Price et al. [2012], которые протестировали 34 изолята от домашних индеек, страдающих инфекцией суставов стопы, и обнаружили, что все изоляты СС398, кроме одного, несут в своих геномах ФAvβ. Таким образом, в птичьих изолятах, подобных человеческому S.aureus , ген hlb инактивируется в результате фаговой конверсии.

    Лошади

    Помимо свиней, штаммы CC398 также часто встречаются у лошадей. Интересно, что изоляты лошади S. aureus являются положительными в отношении фагов Sa3int, несущих IEC [Walther et al., 2018]. Это может потенциально принести пользу этим изолятам, поскольку носительство IEC в MRSA-ST398, по-видимому, способствует выживанию бактерий в присутствии полиморфных нейтрофилов человека и лошади [Jung et al., 2017]. Несколько других линий лошадей (например, CC9 или CC1) приобрели фаг Sa6int, кодирующий новый специфичный для лошадей аллель SCIN (eqSCIN), а также специфичную для лошадей форму двухкомпонентного лейкоцидина LukPQ [de Jong et al., 2018 ; Мама и др., 2019]. В этих линиях фаг Sa3int обычно отсутствует.

    Крупный рогатый скот

    Было показано, что коровы являются наиболее частыми реципиентами S. aureus , но они также, по-видимому, являются первичными животными-резервуарами для повторного заражения людей и появления эпидемических клонов человека животного происхождения [Spoor et al., 2013; Ричардсон и др., 2018]. С . Штаммы aureus , относящиеся к MLST CC97, являются основной причиной мастита крупного рогатого скота в Европе, Азии, Северной и Южной Америке и представляют собой серьезное экономическое бремя для мировой молочной промышленности. По оценкам, первоначальный переход от человека к крупному рогатому скоту произошел примерно 5500 лет назад, что совпало с распространением одомашнивания крупного рогатого скота по всему Старому Свету. Однако было также показано, что CC97 является новой причиной инфекций человека примерно за 40 лет.Эти данные показывают, что изоляты СС97, циркулирующие среди населения, являются результатом переходов от домашнего скота к человеку, происходящих как минимум в двух независимых случаях. По оценкам, переход клады A СС97 от крупного рогатого скота к человеку произошел между 1894 и 1977 гг. изоляты произошли после их передачи человеку [Spoor et al., 2013].Штаммы СС8, выделенные от крупного рогатого скота, страдающего субклиническим маститом, появились после перехода от человека к быку, что связано с потерей фагов Sa3int [Kumagai et al., 2007; Реш и др., 2013]. Анализ изолятов S. aureus от крупного рогатого скота в Германии показал, что большинство изолятов принадлежало к близкородственным СС8, СС25 и СС97 (в совокупности 34,4%) или было родственно секвенированному бычьему штамму RF122. Интересно, что 82% этих изолятов также были hlb положительными [Monecke et al., 2007].

    Кролики

    CC121 представляет собой глобально распространенный высоковирулентный CC у людей, но также связан с заболеванием кроликов на фермах. Происхождение кроличьей линии CC121 восходит к переходу хозяина от человека к кролику, который произошел примерно 40 лет назад [Viana et al., 2015]. Сравнительный анализ дополнительных геномов человеческих штаммов ST121 показал, что все, кроме одного, содержали фаг Sa3int, тогда как все штаммы ST121 кроликов были Sa3int-отрицательными.

    Дикие грызуны и мыши из животноводческих помещений

    Дикие грызуны часто колонизируются различными адаптированными к мышам линиями S. aureus (например, CC49 и CC88, CC130, CC1956), в которых отсутствуют специфические для человека факторы вирулентности, такие как суперантигены и IEC [Mrochen et al., 2018b, 2020]. Интересно, что лабораторные мыши также несут большое разнообразие клеток S. aureus CC, большинство из которых, вероятно, происходят из человеческой популяции, но также не имеют фагов Sa3int. В то время как CC88 распространился по нескольким континентам в течение трех десятилетий, другие CC спорадически внедряются в животноводческие помещения с ограниченным распространением [Mrochen et al., 2018а]. Подобно мышам, свободноживущих и лабораторных крыс часто колонизируют S. aureus [Raafat et al., 2020]. Было показано, что свободноживущие крысы преимущественно колонизированы СС130 и СС49, в то время как содержащиеся в неволе крысы со свиноферм в основном колонизированы штаммом скота СС398. Кроме того, лабораторных крыс чаще всего колонизировали штаммами СС15 и СС8 человеческого происхождения. Было обнаружено, что только 2,7% свободноживущих крыс и ни одна из содержащихся в неволе диких крыс несут гены, кодируемые IEC.Тем не менее, 59% лабораторных крыс содержали гены IEC, подтверждающие недавний скачок от человека к крысе.

    Обезьяны

    Имеются множественные антропонозные передачи S. aureus от человека к зеленым мартышкам, а появление связанной с обезьяной клады S. aureus произошло примерно 2700 лет назад. Развитие этой ассоциированной с обезьянами клады сопровождалось потерей фага Sa3int [Senghore et al., 2016], что указывает на то, что специфичность IEC исключает приматов, отличных от человека.

    Роль фаговой конверсии в инфицировании/колонизации человека

    Термин фаговая конверсия был введен при первом описании фага Sa3int [Coleman et al., 1989] и уже указывает на то, что IEC или Hlb могут выполнять различные функции в различных условиях. Однако актуальность переключения между фаговой интеграцией и иссечением в отношении исхода инфекции или колонизации остается неясной. Человеческая специфичность IEC затрудняет анализ на соответствующих животных моделях.Тем не менее, основываясь на обсервационных исследованиях на людях, представляется, что восстановление Hlb при некоторых инфекционных состояниях благоприятно для бактерий. Сравнение колонизирующих и инвазивных популяций штамма S. aureus показало, что инвазивные штаммы чаще являются Hlb-позитивными [Hedström and Malmqvist, 1982; Пикок и др., 2002; Гёрке и др., 2009]. Примечательно, что большинство фагов Sa3int остаются индуцируемыми, что приводит к полному восстановлению функциональных возможностей Hlb [Goerke et al., 2006b; Сальгадо-Пабон и др., 2014], и индукция фагов может быть предпочтительной при инфекционных условиях. Активные формы кислорода, образующиеся при инфекции или других факторах, повреждающих ДНК (например, хинолоновые антибиотики), хорошо известны своей способностью индуцировать фаги [Goerke et al., 2006a; Танг и др., 2017]. Анализ последующих изолятов от больных муковисцидозом (МВ) показал, что транслокация фага Sa3int часто приводит к разделению бактериальной популяции [Goerke et al., 2006b] на Hlb-положительные (фаго-вылеченные) и фаго-положительные фракции. .Также было показано, что штаммы CC398, отрицательные по фагу Sa3int, постоянно колонизируют пациентов с МВ без приобретения фагов Sa3int во время длительной колонизации [Treffon et al., 2020], подтверждая идею о том, что при инфекции легких при МВ факторы, кодируемые Sa3int, имеют меньшее значение. Hlb, по-видимому, также способствует бактериемии. Было показано, что SAK-дефицитные изоляты более чем в 4 раза чаще вызывают летальную бактериемию, чем SAK-положительные изоляты, что позволяет предположить, что интактный ген hlb и/или дефицит SAK могут ухудшать исходы у пациентов с S.aureus бактериемия [Jin et al., 2003; Квечинский и др., 2013]. Бойл-Вавра и др. [2011] сравнили изогенную пару даптомицин-чувствительных и даптомицин-резистентных изолятов MRSA от пациента с рецидивирующей бактериемией. Ген hlb был прерван профагом в чувствительном к даптомицину штамме, но этот фаг отсутствовал в последующем изоляте, устойчивом к даптомицину. Также было показано, что неповрежденный ген hlb связан с бактериемией, связанной с катетером [Pérez-Montarelo et al., 2018], и 45% изолятов от рецидивирующего фурункулеза продуцировали Hlb по сравнению с 19% изолятов, связанных с назальной колонизацией [Hedström and Malmqvist, 1982].

    Результаты анализов с использованием нескольких животных моделей подтверждают, что инфекция может выбирать потерю фагов Sa3int. Катаяма и др. [2013] наблюдали потерю IEC-кодирующего профага у S. aureus MW2 во время адаптации к мышиной коже. Интересно, что штамм начал продуцировать Hlb, что способствовало более чем 50-кратному увеличению колонизации кожи мышей S.золотистый . Hlb-положительные варианты MW2 также возникают в вегетации крови, почек и сердца инфицированных кроликов [Salgado-Pabón et al., 2014]. Связанный с инфекцией S . Изоляты aureus часто представлены в виде вариантов небольших колоний (SCV), которые часто нестабильны и проявляют ослабленную вирулентность, хотя этот фенотип обратим. Эти SCV часто связаны с активацией профага Sa3int, что приводит к образованию циркулярно-вырезанных форм (в 25 раз выше по сравнению с вариантами колоний дикого типа и нормальных вариантов), но они не могут реплицироваться [Guérillot et al., 2019]. Предполагалось, что вырезание фага приводит к большему количеству копий генов, кодируемых IEC, что приводит к общей более высокой экспрессии.

    На сегодняшний день остается в значительной степени неясным, при каких условиях и почему экспрессия генов IEC, кодируемых фагом, будет выгодна для бактерий. Эпидемиологические данные указывают на некоторое преимущество IEC в установлении или поддержании колонизации носа. Действительно, sak и chp сильно экспрессируются во время колонизации S. aureus , как показали анализы экспрессии генов, проведенные в мазках из носа от персистирующих S.aureus [Burian et al., 2010]. Можно предположить, что SAK может обеспечить некоторые преимущества, основанные на его антифагоцитарных свойствах. Инактивация дефензинов, присутствующих в полости носа, посредством SAK также может обеспечить дополнительное преимущество выживания бактерий. ЧИПС предотвращает хемотаксис и, таким образом, иммунную активацию, что может способствовать длительной бессимптомной колонизации. Однако эта гипотеза была поставлена ​​под сомнение результатами исследования колонизации [Verkaik et al., 2011], в котором добровольцев искусственно колонизировали S.aureus , штамм NCTC 8325-4, с фагом Sa3int phi13 или без него. Интраназальную выживаемость отслеживали в течение 28 дней после инокуляции, и неожиданно оказалось, что штамм, несущий phi13, элиминировался быстрее, чем штамм, не содержащий фага. Таким образом, этот фаг Sa3int не является существенным на первых стадиях назальной колонизации S. aureus .

    Механизмы молекулярного переключения

    Поддержание и мобилизация/утрата фагов, вероятно, контролируются различными молекулярными механизмами.Несмотря на обычно сильную ассоциацию типа int с расположением родственного сайта attB, также существуют события, во время которых фаг может интегрироваться в нелегитимный сайт прикрепления. Было показано, что это явление имеет место для фагов Sa3int при хронических инфекциях легких у больных муковисцидозом [Goerke et al., 2006b]. В этих условиях восстановление прерванного фагом гена hlb может оказаться выгодным. Когда эти неправильно расположенные фаги были индуцированы и использованы для повторного заражения S.aureus in vitro, фаги реинтегрировались в свой выделенный сайт прикрепления в пределах hlb . Имеются также данные [Goerke et al., 2006b; Дойч и др., 2018; Tran et al., 2019], что фаги Sa3int могут осуществлять «активную лизогению», процесс, во время которого фаг временно вырезается из хромосомы без образования интактных фаговых частиц [Feiner et al., 2015]. Благодаря этому процессу бактерии могут одновременно активировать гены вирулентности фага, а также ген, который обычно инактивируется при интеграции фага.Это явление можно рассматривать как форму регуляции бактериального гена, которая, возможно, улучшает приспособленность бактерий. Кроме того, фаги, вероятно, индуцируются при различных инфекционных условиях, что усиливает транскрипцию дополнительных генов фагов, таких как SAK [Goerke et al., 2006a]. Однако молекулярный анализ для выяснения таких механизмов переключения в настоящее время отсутствует для фагов S. aureus . В то время как присутствие cI-подобного репрессора часто можно предсказать по последовательности генома, частота и функция других регуляторных факторов, участвующих в переключении лизогенного лизиса, должны быть экспериментально охарактеризованы.Примечательно, что мало исследований было посвящено выяснению регуляторных систем фагов S. aureus . Следовательно, роль большинства генных продуктов, влияющих на жизненный цикл фага, остается невыясненной.

    Заключение и перспективы

    Эпидемиологические данные четко указывают на то, что фаги Sa3int эволюционировали вместе с хозяином S. aureus , чтобы облегчить адаптацию этого вида бактерий к человеку-хозяину. Фаги остаются очень мобильными, чтобы при необходимости ослабить экспрессию прерванного гена hlb , и это может быть достигнуто посредством активной лизогении, временной релокализации фага или фагового отверждения в отдельной части бактериальной популяции.Для фагов S. aureus анализ таких механизмов переключения in vivo проводится редко, и основной механизм, контролирующий жизненный цикл фага, еще предстоит выяснить. Кроме того, генетический состав штаммов-хозяев, вероятно, определяет скорость мобилизации фагов во время инфекции, что может определять скорость, с которой определенные штаммы могут достичь адаптации хозяина. За исключением RecA, еще предстоит открыть стафилококковые факторы, контролирующие жизненный цикл фага.

    Благодарность

    Мы благодарим Шилпу Джордж за создание фигурки.

    Конфликт интересов

    У авторов нет конфликта интересов, о котором следует заявить.

    Источники финансирования

    Работа финансировалась Deutsche Forschungsgemeinschaft, GRK GRK1708 для CW и CR, а также за счет инфраструктурного финансирования Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Кластер передового опыта EXC 2124 «Контроль микробов для борьбы с инфекциями ». Спонсоры не имели никакого влияния на подготовку рукописи.

    Вклад авторов

    Оба автора (C.R. и C.W.) внесли равный вклад в написание рукописи.

    Эта статья находится под лицензией Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License (CC BY-NC). Использование и распространение в коммерческих целях требует письменного разрешения. Дозировка препарата: авторы и издатель приложили все усилия, чтобы гарантировать, что выбор препарата и дозировка, указанные в этом тексте, соответствуют текущим рекомендациям и практике на момент публикации.Тем не менее, в связи с продолжающимися исследованиями, изменениями в правительственных постановлениях и постоянным потоком информации, касающейся лекарственной терапии и реакций на лекарства, читателю настоятельно рекомендуется проверять вкладыш в упаковке для каждого лекарства на предмет любых изменений в показаниях и дозировке, а также для дополнительных предупреждений. и меры предосторожности. Это особенно важно, когда рекомендуемый агент является новым и/или редко используемым лекарственным средством. Отказ от ответственности: заявления, мнения и данные, содержащиеся в этой публикации, принадлежат исключительно отдельным авторам и участникам, а не издателям и редакторам.Появление рекламы и/или ссылок на продукты в публикации не является гарантией, одобрением или одобрением рекламируемых продуктов или услуг или их эффективности, качества или безопасности. Издатель и редактор(ы) отказываются от ответственности за любой ущерб, нанесенный людям или имуществу в результате любых идей, методов, инструкций или продуктов, упомянутых в содержании или рекламе.

    Фаг 101 – бактериофаговая терапия

    Бактериофаги в природе

    Происходящие от греческих слов, означающих «пожиратель бактерий», бактериофаги широко распространены повсюду — на суше, в воде, в любой форме жизни, укрывающей их цель.По словам Фореста Роуэра, доктора философии, микробиолога-эколога из Университета штата Сан-Диего, и его коллег в их книге Жизнь в нашем мире фагов, фаги вызывают триллион триллионов успешных инфекций в секунду и уничтожают до 40 процентов всех бактериальных клеток в океане каждый день.

    Существуют тысячи разновидностей фагов, каждая из которых эволюционировала, чтобы заражать только один тип или несколько типов бактерий. Как и другие вирусы, они не могут воспроизводиться сами по себе, а должны присваивать репродуктивный механизм бактерий.Для этого они прикрепляются к бактерии и вставляют свой генетический материал. Затем литические фаги разрушают клетку, расщепляя ее и высвобождая новые вирусные частицы, которые, в свою очередь, заражают больше бактерий.

    Фаги в качестве терапии

    История болезни

    Фаги (зеленые) прикрепляются к бактерии

    Хотя вопрос об первооткрывателе бактериофагов остается предметом споров, широко признано, что в 1915 году Фредерик Творт, бактериолог из Англии, первым предположил, что это был вирус, который был ответственность за предыдущие наблюдения «фактора», убивающего бактерии.Два года спустя Феликс д’Эрель, микробиолог из Института Пастера в Париже, продолжил то, на чем остановился Туорт, и впервые предложил фаги в качестве терапии инфекций человека. Первое известное терапевтическое использование фагов произошло в 1919 году, когда д’Эрель и несколько стажеров больницы проглотили фаговый коктейль, чтобы проверить его безопасность, а затем дали его 12-летнему мальчику с тяжелой дизентерией. Симптомы у мальчика исчезли после однократной дозы, и он полностью выздоровел в течение нескольких дней. Однако д’Эрель не публиковал свои выводы до 1931 года.

    В 1920-х и 30-х годах исследователи по всему миру продолжали изучать и тестировать фаги на предмет их способности лечить бактериальные инфекции у людей. Однако большая часть результатов этих исследований была опубликована в неанглоязычных журналах и поэтому не сразу распространилась в Западной Европе и США. для лечения ряда бактериальных инфекций, в том числе при ранах и инфекциях верхних дыхательных путей.Но предполагалось, что фаги работают не так уж хорошо, отчасти из-за того, что они неправильно хранились или очищались, и в то время не было признано, что многие фаги очень избирательны в отношении бактерий, которые они заражают. Фаговая терапия потеряла популярность в США и большей части Европы с появлением антибиотиков. Только в регионах, где антибиотики были не так легко доступны, а именно на территории современной России, Польши и Республики Грузия, продолжалась фаготерапия и коммерческое производство.Однако исследования фагов, проведенные в этих регионах, по-прежнему носили нерандомизированный и неконтролируемый характер, и, таким образом, по-прежнему отсутствуют эмпирические данные, подтверждающие эффективность фаготерапии.

    Сегодняшний день

    Западные ученые «заново открыли» фаговую терапию в 1980-х годах. С тех пор растущая угроза устойчивых к антибиотикам бактериальных штаммов продолжает вызывать интерес к фаготерапии как к потенциальной альтернативе. В 2000-х эксперименты на людях снова начались, и данные первой фазы клинических испытаний в США.S. было опубликовано в 2009 году. В этом испытании была проверена безопасность коктейля фагов, специфичных для кишечная палочка , Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa у 42 пациентов с хроническими язвами нижних конечностей. Поскольку это была фаза 1 исследования, в исследовании анализировалась только безопасность, а не клинические результаты. О побочных эффектах, связанных с фагами, не сообщалось.

    Еще одно недавнее рандомизированное двойное слепое контролируемое исследование было проведено в Великобритании, в ходе которого ученые тестировали шесть бактериофагов у пациентов с хроническими инфекциями уха, вызванными С.палочка . Количество бактерий значительно уменьшилось в группе, получавшей лечение, эти пациенты также сообщили об ослаблении симптомов и отсутствии побочных эффектов, связанных с лечением. В 2014 году исследователи в Бельгии начали небольшое клиническое испытание для проверки фаготерапии на жертвах ожогов, чьи раны инфицированы вирусом. Е. coli или Бактерии P. aeruginosa . Результаты еще не были полностью опубликованы, но о проблемах с безопасностью не сообщалось.

    Доктор медицинских наук Роберт Скули из UC San Diego Health и доктор медицинских наук Рэнди Таплитц вводят внутривенную экспериментальную фаговую терапию пациенту Тому Паттерсону в марте 2016 года, через четыре месяца после того, как он заразился бактериальной инфекцией с множественной лекарственной устойчивостью в Египте.Предоставлено: UC San Diego Health

    В Йельском университете бактериофаг, взятый из местного пруда, недавно использовали для лечения опасной для жизни бактериальной инфекции грудной клетки 80-летнего мужчины. Тот случай, описанный в выпуске журнала от 26 мая 2016 г. Scientific Reports , похоже на лечение Тома Паттерсона в Калифорнийском университете в Сан-Диего, но только в том смысле, что они оба использовали бактериофаги. Успех в случае с Йельским университетом, по-видимому, зависел от превращения бактерий ( Pseudomonas aeruginosa ) в штамм, чувствительный к антибиотикам.

    До случая с Томом Паттерсоном в 2016 году в Калифорнийском университете в Сан-Диего, очень немногие пациенты в США получали внутривенную фаговую терапию для непосредственного уничтожения бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, особенно после появления антибиотиков.


    Преимущества

    Фаги могут помочь преодолеть основные недостатки современных антибиотиков. Антибиотики имеют широкий спектр действия, а это означает, что помимо уничтожения вредоносных видов, вызывающих инфекцию, антибиотики также уничтожают многие полезные бактерии, составляющие микробиом человека, и это может иметь различные краткосрочные и долгосрочные последствия для здоровья.Бактерии также быстро размножаются, а селективное давление антибиотиков способствует появлению устойчивых к антибиотикам штаммов.

    Напротив, фаги очень специфичны в отношении бактерий, которые они заражают, поэтому сопутствующий ущерб другим бактериям или клеткам человека минимален. Хотя у бактерий может развиться устойчивость к фагам (в конечном итоге они могут потерять поверхностные рецепторы, которые фаги используют для стыковки и проникновения в клетки), риск невелик. Более того, поскольку в природе существует почти неисчерпаемый запас фагов, в случае возникновения резистентности исследователи теперь могут найти новые фаги, использующие другие рецепторы, как это было в случае с Томом Паттерсоном.Такой подход может быть ускорен с использованием фаговых библиотек. Наконец, на разработку антибиотиков уходят годы, в то время как фаговый коктейль можно идентифицировать и сопоставить с конкретной бактериальной инфекцией пациента, а затем очистить в течение нескольких дней, что делает персонализированную фаговую терапию по требованию потенциальной реальностью в будущем.

    Риски

    Учитывая, что тестирование фаготерапии на сегодняшний день в основном было наблюдательным или проводилось в рамках небольших нерандомизированных испытаний, исследователи еще не имеют полной картины того, как это работает, и потенциальных рисков.Они еще не знают степени потенциальных краткосрочных и долгосрочных побочных эффектов фаготерапии. Десятилетия отдельных сообщений из России, Польши и Республики Грузия, а также доклинические исследования на животных показывают, что фаговая терапия, вероятно, безопасна для большинства людей, по крайней мере, при местном нанесении на кожу. Однако, учитывая отсутствие контроля и прозрачности, также возможно, что побочные эффекты были занижены.

    Септический шок является основным поводом для беспокойства врачей, планирующих фаготерапию.Это связано с тем, что многие типы бактериальных клеток выделяют эндотоксины при разрушении фагами, что может привести к подавляющему иммунному ответу и отказу органов. Тем не менее, это также является проблемой для некоторых доступных в настоящее время антибиотиков. Не было никаких доказательств того, что эндотоксины вызывают септический шок в ответ на фаговую терапию в случае Тома Паттерсона, и о септическом шоке не сообщалось широко за многие десятилетия фаговой терапии в Восточной Европе.

    Наконец, фаги способны переносить ДНК от одной бактерии к другой в ходе естественного и широко распространенного процесса, известного как трансдукция.Манипуляции с фагами и искусственная интродукция теоретически могут ввести новые факторы вирулентности или токсины в уже патогенные бактерии или превратить непатогенные бактерии в патогены. Тем не менее, эту проблему можно решить путем предварительного отбора фагов, которые были тщательно проверены на наличие токсинов и факторов вирулентности — усилия, которые можно облегчить, используя постоянно расширяющиеся библиотеки фагов, которые в настоящее время разрабатывают несколько групп по всему миру.

    Проблемы

    Основные проблемы фаговой терапии: 1) врачи должны точно знать, какой бактериальный штамм вызывает инфекцию, и 2) они должны иметь в наличии несколько фагов, специально нацеленных на этот штамм, в идеале из большой библиотеки фагов, которая может пройти скрининг на наличие подходящего фагового коктейля, соответствующего бактериям.Последняя проблема усугубляется тем, что большинство фармацевтических компаний неохотно выделяют ресурсы на разработку и коммерциализацию фаготерапии. Это связано с тем, что фаговой терапии уже почти 100 лет, что затрудняет патентование и получение дохода, чтобы оправдать первоначальные затраты на разработку.

    Отсутствие разрешения регулирующих органов на фаговую терапию также является проблемой. Фаговые коктейли должны быть адаптированы для инфекции каждого пациента и постоянно корректироваться по мере развития бактерий и развития устойчивости.Регулирующим органам, таким как Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA), в настоящее время не хватает упорядоченных механизмов проверки и утверждения для обеспечения персонализации и гибкости в больших масштабах. Будущее

    Инновации в диагностике, основанные на преимуществах геномного секвенирования и масс-спектрометрии, вскоре могут удовлетворить потребность в быстрой и точной идентификации бактерий. Второе препятствие фаготерапии, потребность в легкодоступных фагах, может быть в конечном счете частично преодолена U.Медицинский исследовательский центр S. Navy и другие группы по всему миру, которые в настоящее время создают библиотеки фагов.

    Забегая вперед, можно сказать, что другие технологические достижения могут помочь сделать фаговую терапию еще более конкретной и помочь в решении патентной проблемы. Например, в конечном итоге фаги могут быть созданы с использованием методов редактирования генов CRISPR/Cas9, чтобы убивать только устойчивые к антибиотикам бактерии. Тогда компании с большей вероятностью получат патенты на уникальные фаги или фаговые коктейли, что сделает их коммерчески выгодными инвестициями.

    Каким бы ни было будущее фаготерапии, большинство экспертов сходятся во мнении, что фаготерапия никогда полностью не заменит антибиотики. Вместо этого этот подход можно использовать в сочетании с антибиотиками или в качестве последней линии защиты для пациентов с инфекциями, которые не ответили ни на какое другое лечение. Учитывая тревожный рост в последние годы числа опасных для жизни инфекций с множественной лекарственной устойчивостью, необходимо срочно изучить потенциальную роль фаготерапии и других альтернатив антибиотикам.

    Дополнительную информацию см.:

    Сулаквелидзе и др. Бактериофаговая терапия. Антимикробные агенты Chemother . 2001 март; 45(3): 649–659.

    Виттеболе и др. Исторический обзор бактериофаговой терапии как альтернативы антибиотикам для лечения бактериальных возбудителей. Вирулентность . 1 января 2014 г .; 5(1): 226–235.

    Выделение нового литического бактериофага против нозокомиального метициллин-резистентного Staphylococcus aureus, принадлежащего к ST45

    Метициллин-резистентный Staphylococcus aureus (MRSA) может вызывать широкий спектр инфекций от легких до опасных для жизни состояний.Его повышенная устойчивость к антибиотикам часто приводит к терапевтическим неудачам, поэтому необходимо рассмотреть альтернативные методы эрадикации. Потенциальными кандидатами для борьбы с инфекциями MRSA являются бактериофаги и их литические ферменты, лизины. В этом исследовании мы выделили бактериофаг против нозокомиального штамма MRSA, принадлежащего к эпидемиологической группе ST45. Фаг, принадлежащий к Caudovirales , Siphoviridae , показал узкий круг хозяев и стабильную литическую активность без появления резистентных клонов MRSA.Филогенетический анализ показал, что вновь выделенный Staphylococcus фаг R4 принадлежит к роду Triavirus семейства Siphoviridae . Генетический анализ последовательности R4 длиной 45 т.п.н. выявил 69 ОРС. Остаток мобильных генетических элементов и следов укороченных генов не наблюдалось. Мы локализовали ген лизина (N-ацетилмурамоил-L-аланинамидаза) нового фага, который был амплифицирован, клонирован, экспрессирован и очищен. Его активность подтверждена анализом зимограммы.Наши результаты потенциально могут быть использованы для разработки специфических терапевтических стратегий на основе бактериофагов и фаговых лизинов против MRSA против основных клональных линий и серотипов.

    1. Введение

    Staphylococcus aureus считается одним из наиболее важных возбудителей внутрибольничных инфекций, поражающих кожу, органы дыхания, кости и мягкие ткани. Эти инфекции часто представляют собой серьезную угрозу из-за преобладания полирезистентности к антибиотикам среди изолятов [1].Метициллин-резистентный штамм S. aureus (MRSA) демонстрирует высокий риск развития резистентности ко всем доступным антибиотикам в ближайшем будущем [2].

    Изоляты были разделены на три основные группы в соответствии с клинической и молекулярной эпидемиологией: (1) связанные со здравоохранением (HA), (2) внебольничные (CA) и (3) связанные с домашним скотом (LA) MRSA. Различие между этими группами стало размытым, поскольку пути начала и последующего заражения могут различаться [3].

    Мультилокусное типирование последовательностей (MLST) — широко распространенный метод изучения происхождения, эволюции и структуры клональной популяции изолятов MRSA [4].С помощью этого метода можно дифференцировать несколько типов последовательностей (ST), включая ST1, ST5, ST8, ST22, ST30, ST80 и ST239, которые являются наиболее часто выделяемыми глобальными клонами [5]. Появляющимся типом ST является ST45, ближайший родственник ST5 и ST22 и главный международный представитель эпидемической группы MRSA (EMRSA) [4]. Сообщалось, что ST45 является одним из преобладающих типов последовательностей HA-MRSA и CA-MRSA в Европе [6–9], Северной Америке [10, 11], Азии [12–16] и Австралии [17]. Этот тип последовательности был связан с множественными серьезными инфекциями [10, 18] и полирезистентностью к антибиотикотерапии [10].

    Поскольку устойчивость изолятов к антибиотикам растет, необходимо серьезно рассматривать новые методы в качестве потенциальных терапевтических или профилактических средств.

    Бактериофаги (фаги) представляют собой бактериальные вирусы, способные убивать бактериальную клетку-мишень. Уникальные свойства бактериофагов позволяют им распознавать специфические рецепторные структуры на поверхности бактериальных клеток, прикрепляться к ним и инфицировать клетку-хозяин, высвобождая потомство фага [19].

    Все известные фаги, инфицирующие S.aureus являются членами порядка Caudovirales [20] и продуцируют лизины, группу эволюционно продвинутых муралитических литических ферментов, которые гидролизуют пептидогликан клеточной стенки бактерий [21, 22].

    Применение бактериофагов против S. aureus успешно реализовано на различных моделях и в медицине. Их in vivo антибактериальные эффекты и, тем самым, их raison d’etre в терапии были продемонстрированы в некоторых недавних исследованиях [19, 23–26].Однако способность бактерий вырабатывать резистентность к определенным фагам [27] требует разумных терапевтических подходов. Помимо применения идеальных фагов широкого круга хозяев S. aureus , для полного терапевтического охвата необходимо также рассматривать фаги узкого круга [28–31]. Это может потенциально устранить появление бактериальной резистентности и может усилить немедленный противомикробный эффект, поскольку теоретически различные фаги могут задействовать больше типов фаговых рецепторов в сложной структуре клеточной оболочки S.aureus [32, 33]. Использование библиотеки множества стафилококковых фагов с различной специфичностью рецепторов позволяет нам воздействовать на более широкий спектр бактериальных штаммов, а с помощью фагов с узким кругом хозяев можно получить терапевтический эффект широкого круга хозяев. Таким образом, создание фаговых библиотек является важной стратегией в развитии фаговой терапии.

    Рекомбинантные ферменты литических фагов, такие как эндолизины или вирион-ассоциированные лизины (VAL), являются потенциальными кандидатами для терапии, деколонизации и, таким образом, профилактики инфекций [34–36].Лизины связываются и расщепляют высококонсервативные структуры в пептидогликановом слое, которые в высокой степени неизменны; таким образом, резистентность к ним — редкое явление [21]. Следовательно, рекомбинантные эндолизины являются противомикробными агентами [37] с высоким потенциалом лечения грамположительных бактериальных инфекций, таких как MRSA [38, 39].

    В этом исследовании мы выделили новый литический бактериофаг (R4), который был эффективен против резидентного изолята HA-MRSA, происходящего из немецкой больницы и принадлежащего к международной клональной группе ST45 с растущим эпидемиологическим потенциалом.Мы идентифицировали, клонировали и экспрессировали разрушающий клеточную стенку эндолизин (амидазу). Наши результаты могут помочь в разработке терапевтических стратегий на основе бактериофагов против MRSA, нацеленных на основные клональные линии.

    2. Материалы и методы
    2.1. Бактериальные штаммы и условия роста

    Клинически устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA) изолят 06-01019 (ST45) был выделен из ноздри госпитализированного пациента на селективном маннитол-солевом агаре.Подтверждение видов было выполнено с использованием масс-спектрометрии с лазерной десорбцией / ионизацией и временем пролета с матрицей (MALDI-TOF MS) (Vitek MS, Biomerieux, Марси-л’Этуаль, Франция). Бактерию обычно выращивали на чашках с агаром с лизогенным бульоном (LB) при 37°C или в жидкой среде LB (37°C при 125 об/мин). Для создания бактериального газона 100  мкл л ночной (НН) жидкой культуры высевали на твердую чашку с агаром LB и инкубировали НН при 37°С. Для амплификации бактерий и/или фагов ОН-культуры выливали в большее количество жидкой среды и инкубировали при 37°С на орбитальном шейкере.

    2.2. Выделение, размножение и определение титра фагов

    Бактериофаги выделяли из местной сточной фермы (Пеллерд, Венгрия) традиционным методом [40]. Вкратце, 1 мл образца сточных вод совместно инкубировали с 50 мл средней логарифмической суспензии изолята 06-01019 ON при 37°C. Суспензию центрифугировали (4000 об/мин, 10 мин) и супернатант обрабатывали хлороформом в соотношении 1:50 (Molar Chemicals Kft., Halásztelek, Венгрия) ON при 4°C. Наличие литических фагов было подтверждено методом выборочного тестирования [40] на газоне изолята 06-01019.Одиночную фаговую бляшку вырезали методом наложения агара [41] и очищали в три последовательных этапа. Очищенный фаговый клон, названный «Стафилококковый фаг R4» в соответствии с последней номенклатурой фагов [42], размножали в 100 мл среды LB, центрифугировали (11 000 об/мин, 30 мин) и ресуспендировали в 50 мл деионизированной воды (DW). Титр фага получали серийным разведением суспензии фага и последующим нанесением 10 мкл из разведений, чтобы получить исчисляемое количество отдельных бляшек на газоне.Затем рассчитывали количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 1 мл концентрированной суспензии. Полученную суспензию с высоким титром (10 9 БОЕ/мл) использовали для дальнейших исследований.

    2.3. Определение диапазона хозяев и обнаружение устойчивости к фагам

    Диапазон хозяев фага R4 был определен путем точечного тестирования на 42 штаммах MRSA и 3 штаммах S. aureus из разных коллекций. Из MRSA 14 HA-MRSA и CA-MRSA обладали известными типами последовательностей, как указано в таблице 1.Чистое пятно указывало на то, что фаг может убивать бактерии. Три различных возможных значения были определены с точки зрения литической эффективности в соответствии с прозрачностью пятна: полное очищение, частичное очищение и отсутствие просветления. Результаты были собраны как среднее из трех различных наблюдений. Появление резистентных мутантов против R4 тестировали на газоне (/100  мк л) клинического метициллин-резистентного Staphylococcus aureus (MRSA) изолята 06-01019 (ST45) путем закапывания 10  мкл л плотного фага суспензии (10 9 БОЕ/мл) и дайте ей высохнуть.Эта область, покрытая фагом, содержала 10 7 БОЕ R4 и окружающих бактерий. Через 24 часа инкубации визуально определяли отсутствие или появление устойчивых к фагам клонов.


    91 458 Тип последовательности
    91 458 91 478 HA-MRSA ST254 ST45 0 MRSA штаммы) ОЭК В настоящее время не лизис ОЭК АТСС
    Вид Штамм код / происхождение R4 фага эффект
    06-01388 ST247 нет лизис
    93-01000 Полный лизис
    06-01597 ST239 В настоящее время не лизиса
    06-02182 ST22 нет лизис
    06-01019 Полный лизис
    06-01750 ST228 В настоящее время не лизиса
    06-00219 ST5 Нет лизис
    06-00409 ST225 Без лизиса

    CA- MRSA 03-02773 ST1 Полный лизис
    06-00631 ST5 Частичный лизис
    06-00373 ST8 Частичный лизис
    05-01089 ST22 Частичный лизис
    06-02000 ST80 Нет лизис
    06-00467 ST152 без лизиса


    N4315 Без лизиса
    MW2 91 455 Ни один лизис
    MU3 В настоящее время не лизис
    MU50 В настоящее время не лизис
    S30 В настоящее время не лизис
    CI6005 В настоящее время не лизис
    Ci5734 без лизиса
    116539 без лизиса
    116550 без лизиса

    S.стафилококк 112016
    112017 В настоящее время не лизис
    29213 Нет лизис

    2,4. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ)

    Морфологию фага R4 проводили с помощью ТЭМ, как описано недавно [43]. Вкратце, 10  мкл мкл очищенного исходного фага с высоким титром (10 9 БОЕ/мл) наносили на покрытые формваром медные сетки (Pelco Grids, Реддинг, Канада) и отрицательно окрашивали 1.5% фосфовольфрамовой кислоты (Merck KGaA, Дармштадт, Германия) в течение 40 секунд. После сушки фаги визуализировали на просвечивающем электронном микроскопе JEM-1400 Flash TEM (JEOL USA Inc., Пибоди, США), работающем при ускоряющем напряжении 80 кВ и токе пучка 54  мк А.

    2.5. Определение последовательности генома фага и биоинформатический анализ

    ДНК фага выделяли из фаговых запасов с концентрацией ≥109 БОЕ/мл. Фаговую ДНК выделяли и очищали на основе недавно описанного метода [43].Фаговый лизат из суспензии фага с высоким титром получали с использованием набора QIAGEN Lambda Midi Kit (QIAGEN Inc., Калифорния, США) и следуя протоколу производителя. Очищенную фаговую ДНК растворяли в 100  мкл мкл стерильной не содержащей нуклеаз H 2 O и использовали для приготовления библиотек секвенирования геномной ДНК с использованием набора для подготовки библиотек Nextera XT (Illumina, Калифорния, США). Секвенирование проводили с использованием набора реагентов MiSeq Reagent Kit v2 () на приборе Illumina MiSeq (Illumina, Калифорния, США).Конвейер Mypro использовался для сборки полученных чистых последовательностей.

    Собранная последовательность была аннотирована на сервере RAST (https://rast.theseed.org/FIG/rast.cgi). CLC Sequence Viewer v.6 (CLC bio, Орхус, Дания) использовали для анализа аннотированного генома и иллюстрации карты генома. Открытые рамки считывания (ORF) и предсказания генов были подтверждены программой GeneMarkS [44]. Поиск гомологии проводили с помощью инструментов BLAST, доступных на веб-сайте NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).Фаг R4 был классифицирован в соответствии с рекомендациями Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV, http://talk.ictvonline.org/taxonomy/) при поддержке ViralZone (http://viralzone.expasy.org) и результатов BLASTn. Прогнозирование гомологии белков проводили с помощью инструментов NCBI BLASTp и HHpred из набора инструментов MPI Bioinformatics Toolkit (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/hhpred).

    Нуклеотидная последовательность R4 была депонирована в базе данных GenBank под регистрационным номером MT366568.

    2.6. Филогенетический анализ фага R4

    Филогенетический анализ на основе полного генома был проведен с помощью VICTOR [45] с участием первых 27 очень сходных сифофагов, согласно поиску гомологии. Все попарные сравнения нуклеотидной последовательности были проведены с использованием метода Genome-BLAST Distance Phylogeny (GBDP) в условиях, рекомендованных для прокариотических вирусов. Поддержка ветвей была выведена из 100 реплик псевдозагрузки каждая. Дерево было укоренено в средней точке [46] и визуализировано с помощью FigTree [47].Границы таксонов на уровне вида, рода и семейства оценивали с помощью программы OPTSIL с рекомендуемыми порогами кластеризации и значением (доля связей, необходимых для слияния кластеров) 0,5 [48].

    2.7. Клонирование гена эндолизина

    Разработанные пары грунтовки, содержащие навесные концы с XHO I и HIND III диаментальных сайтов распознавания фермента (5-TAAATGTTA CTCGAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAaaaAAAAAAAAААКТААТКГТГКТААКТТТАТТАКХААААКТКТКТГКТААКТТАКХААААКТАКТКТМ 3 Олдрич, Ст.Louis, США)) использовали для амплификации orf27 , кодирующего эндолизин (амидазу) из очищенной ДНК фага R4. Реакцию ПЦР проводили с использованием смеси ферментов ДНК-полимеразы Pfu (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, США) при следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 2 мин, затем 30 циклов, состоящих из 95°С и 30-секундной денатурации. , 54°C и отжиг 30 секунд, и 72°C и удлинение 1 мин. Амплификацию заканчивали дополнительной 10-минутной фазой постэлонгации при 72°С.Амплифицированный ПЦР-фрагмент отделяли (1% агарозный гель), экстрагировали (Gel Extraction Kit; Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) и клонировали с тупым концом (ON, 20°C) в линеаризованную плазмиду pJET1.2/blunt с помощью с использованием набора для клонирования Clone JET PCR (Thermo Fisher Scientific, Waltham, США). Лигированной смесью подвергали тепловой шок трансформацию в лабораторный штамм Escherichia coli XL1-Blue. Интегрированную ПЦР-вставку подвергали двойному расщеплению с помощью Xho I и Hind III (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, США) и после разделения (1% агарозный гель) и последующей стадии очистки (Gel Extraction Kit) повторно лигировали. в вектор экспрессии Xho I и Hind III, линеаризованный pRSET A (Thermo Fisher Scientific, Waltham, США).Лигированные конструкции осаждали этанолом и после ресуспендирования в DW электропорировали в лабораторные штаммы E. coli DH5 α и BL21 с использованием кювет диаметром 1 мм и системы GenePulser XCell (Bio-Rad, Hercules, США) с Напряжение 1,8 кВ и сопротивление 600 Ом . Трансформированные клетки отбирали на чашках с LB-агаром, содержащим ампициллин (100 мк мкг/мл), и инкубировали на ВКЛ при 37°С. Интеграцию и наличие полученной конструкции orf27 -pRSET A подтверждали двойным расщеплением выделенных плазмид и ПЦР.

    2.8. Экспрессия белков, одномерный гель-электрофорез

    5 мл ON культур (1) BL21, (2) BL21 с pRSET A и (3) BL21, содержащих плазмидную конструкцию orf27 -pRSET A, использовали для начала логарифмической фазы ( OD 600 =0,8) культур и далее инкубировали без (контроль) и с изопропил- β -D-тиогалактозидом (IPTG) до конечной концентрации 2 мМ. Из полученных культур брали образцы объемом 1 мл в моменты времени 0, 1, 2, 3, 4 и 5 часов.Образцы центрифугировали, а осадки ресуспендировали либо в дистиллированной воде, кипящей при 100°С в течение 10 мин, либо в буфере для обработки ультразвуком (рН 7,4, 50 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА) для обработки ультразвуком. Обработку ультразвуком проводили четыре цикла по 0,5-0,5 секунды пульсации в течение 1 мин при амплитуде 25-30%. После каждого цикла проводили 1-2-минутную инкубацию на льду. Прокипяченные или обработанные ультразвуком образцы смешивали с 1 : 4 () объемом 5x буфера для образцов (0,6 мл 1 М Трис, pH 6,8, 5 мл 50% глицерина, 2 мл 10% додецилсульфата натрия (SDS), 0.5 мл β -меркаптоэтанол, бромфеноловый синий, заливают дистиллированной водой до 10 мл) и подвергают электрофорезу на 10% полиакриламидном геле [49] в течение 1,5 ч при 120 В с использованием системы Bio-Rad Mini Protean II (Bio- Рэд, Геркулес, США). После разделения полосы визуализировали окрашиванием кумасси бриллиантовым синим (R-250, Reanal, Будапешт, Венгрия) [50].

    Аффинную очистку экспрессированного эндолизина на основе полигистидиновой метки проводили из 10 мл логарифмической фазы культуры, которую индуцировали IPTG (2 мМ) в течение 5 часов.Отцентрифугированный осадок ресуспендировали в His-связывающем буфере и обрабатывали ультразвуком, как описано выше. Очистку эндолизина осуществляли с помощью His-Spin Protein Miniprep (Zymo Research, Ирвин, США) в соответствии с протоколом. Очищенный белок также визуализировали электрофорезом в полиакриламидном геле.

    2.9. Зимография

    Зимографический анализ проводили, как описано ранее с модификациями [51]. Вкратце, изолят S. aureus 06-01019 (ST45) выращивали и собирали из 200 мл культуры с логарифмической фазой.После промывания осадка 25 мл лизирующего буфера А (рН 6,2, 50 мМ ацетата аммония, 10 мМ CaCl 2 , 1 мМ дитиотреитола) осадок ресуспендировали в 1,5 мл лизирующего буфера А. Из него 500 мкл л. добавляли к 3 мл лизирующего буфера А, в результате чего получали раствор OD 600 =~10. Из этой густой бактериальной суспензии 500 мкл мкл вводили в общий объем 5 мл 10%-го полиакриламидного разделительного геля (1,665 мл акриламида/бис-акриламида, 1,25 мл 1,5 М Трис (рН 8,8), 5 мкл мкл 10% СДС, 1.7 мл дистиллированной воды, 35 мкл л 10% персульфата аммония и 2,5 мкл л TEMED), который был отлит впоследствии. Обработанные ультразвуком и очищенные образцы подвергали электрофорезу (120 В, 1,5 ч). Затем гель промывали DW в течение 30 мин и буфером для ренатурации (pH 6,9, 25 мМ Tris-HCl, 10 мМ MgCl 2 , 0,1% Triton X-100) при 37°C ON. Гель окрашивали в течение 3 ч 0,1% метиленовым синим, содержащим 0,01% КОН, и обесцвечивали DW до появления просветленных зон.

    3. Результаты
    3.1. Морфологические особенности фага R4

    R4 представляет собой хвостатый фаг с вытянутой головкой примерно 100 нм в длину и 50 нм в ширину. Гибкий хвост имеет длину около 300 нм (рис. 1). Эта морфология характерна для представителей рода Triavirus , семейства Siphoviridae . Фаг образует относительно небольшие отдельные бляшки диаметром 0,5 мм на газоне штамма-хозяина после инкубации в течение ночи при 37°С.


    3.2. Спектр хозяина фага R4 и тестирование устойчивости к фагу

    Результаты определения спектра хозяина можно увидеть в таблице 1.Из 45 исследованных штаммов (включая хозяина) 14 оказались восприимчивыми на разных уровнях к фагу R4, а 31 оказался полностью устойчивым. Помимо штамма-хозяина (06-01019), фаг R4 продемонстрировал сильное литическое действие на один штамм HA-MRSA (ST254) и один штамм CA-MRSA (ST1) (таблица 1). Частичный литический эффект был выявлен в отношении трех штаммов CA-MRSA (ST5, ST8 и ST22). Из еще 19 протестированных изолятов MRSA из другой коллекции 8 оказались чувствительными и показали полный лизис, а 11 оказались устойчивыми. Остальные 9 MRSA и 3 S.aureus из разных коллекций не проявляли чувствительности к фагу R4.

    При исследовании на газоне клинического метициллин-резистентного Staphylococcus aureus (MRSA) изолята 06-01019 (ST45) появления резистентных клонов не выявлено.

    3.3. Геномные свойства фага R4

    Основная статистика генома показала, что фаг R4 имеет двухцепочечную линейную ДНК 27,902 МДа, длину 45 168 пар оснований и содержание G+C 33,3% (37,4% аденина, 13.7% цитозина, 19,6% гуанина, 29,3% тимина).

    Геном гомологичен Staphylococcus фагу SAP8 (MK801680.1), SMSAP5 (JQ779023.1), SH-St 15644 (MG770897.1) и vB_SauS_fPfSau02 (MK348510.1) с охватом 90%, 90% , 85% и 71% и идентичность последовательностей 97,18%, 97,18%, 97,59% и 96,87% соответственно, а также с хромосомами различных штаммов S. aureus , таких как 2395 USA500 (CP007499.1) и AR_0468. (CP029657.1) с охватом 94% и 88% и идентичностью последовательностей 99.22% и 99,19% соответственно. Помимо ранее упомянутых четырех сифофагов, геном демонстрирует гомологию (на разных уровнях) с фагами, классифицированными как представители рода Triavirus , такими как Staphylococcus virus IPLA35 (EU861005.1), phiSLT (AB045978.2), phi12 ( AF424782.1), 3a (AY954956.1), 42e (AY954955.1) и 47 (AY954957.1). Это согласуется с морфологическими свойствами и подтверждает принадлежность фага R4 к роду Triavirus семейства Siphoviridae .

    На рис. 2 показаны филогеномные отношения фага R4 с другими стафилококковыми фагами и выявлено наиболее близкое родство с фагами SAP8, SAP11 и SMSAP5.


    В результате аннотации было получено 69 и 70 кодирующих белок последовательностей с помощью RAST и GeneMarkS соответственно (рис. 3). Функции определенных генов были соответственно предсказаны всеми платформами. Геном демонстрирует модульность, характерную для Staphylococcal Siphoviridae , состоящую из шести функциональных модулей: упаковка ДНК, структура головы, структура хвоста, лизис, лизогения и репликация/метаболизм ДНК.Хотя гены, ответственные за интеграцию, присутствуют, остатков мобильных генетических элементов и следов укороченных генов не наблюдалось.


    3.4. Молекулярные свойства эндолизина фага R4, R4lys

    Геном R4 содержит кассету лизиса, состоящую из лизина и холина (рис. 3, желтые стрелки, гены 26 и 27). orf27 длиной 1455 п.н. (от нуклеотида 22 176 до 23 630), кодирующий эндолизин R4lys длиной 484 аминокислоты, демонстрирует сильное сходство (>96%) с соответствующим сегментом гена Staphylococcus siphophages YMC/09/04/R1988. (KF598856.1), phi12 (AF424782.1), 47 (AY954957.1), Lh2 (JX174275.1) из рода Triavirus , сифофаги 96 (AY954960.1), TEM123 (JQ779024.1) и TEM126 (HQ127381.1 ) рода Phietavirus и многих других сифофагов Staphylococcus , каждый из которых кодирует муралитический пептид. Было предсказано, что эндолизин самого фага R4 представляет собой N-ацетилмурамоил-L-аланинамидазу с двумя предполагаемыми консервативными доменами: амидаза-3 (pfam01520) в середине (остатки аа 181-362) и Sh4b (связывающий клеточную стенку). ) домен на С-конце (остатки 402-470 а.о.).Следовательно, кодирующий ген orf27 был выбран для амплификации и клонирования (фиг. 3) и для экспрессии эндолизина R4lys фага R4.

    3.5. Экспрессия белка и активность амидазы R4lys

    Анализ SDS-PAGE выявил успешную сверхэкспрессию эндолизина R4lys (рис. 4). Единственное усиление конкретной полосы ниже 60 кДа только на дорожках с лизатами BL21, содержащими плазмидную конструкцию orf27 -pRSET A, предполагает наличие сверхэкспрессированного целевого белка.В эксперименте с течением времени было замечено, что IPTG повышает экспрессию с течением времени (данные не показаны). Однако общие результаты показали, что экспрессия белка наблюдалась даже без добавления IPTG, и нет заметной разницы между уровнями экспрессии в образцах, обработанных ON IPTG, и необработанных.


    После очистки R4lys на геле появились четкие полосы, исключительно близкие к полосе лестницы белка 60 кДа, что также указывает на присутствие целевого белка.R4lys не прослеживался с помощью анализа SDS-PAGE из супернатанта центрифугированных ON-культур перед лизисом клеток, даже с использованием различных методов преципитации белка (данные не показаны). По-видимому, белок задерживается в тельцах включения клеток BL21 и не транспортируется во внешнюю среду.

    Между кипячеными и ультразвуковыми образцами не было видно разницы в интенсивности полос на белковом геле. Однако кипячение устраняло ферментативную активность; таким образом, на геле зимограммы не наблюдалось просветляющих зон (рис. 4).Напротив, в отсутствие термической обработки четко наблюдались просветляющие зоны в геле, обусловленные лизисом бактерии-мишени. Другие белки в белковой лестнице или в обработанном ультразвуком BL21 не создавали просветляющих зон, и тем самым подтверждалась амидазная ферментативная активность R4lys.

    4. Обсуждение

    В этом исследовании мы успешно выделили и охарактеризовали новый фаг Staphylococcus , R4, новый член рода Triavirus в Siphoviridae .Мы клонировали и экспрессировали амидазу R4lys фага и показали, что белок обладает литической активностью в отношении пептидогликана исследуемого штамма-хозяина. С помощью функционального анализа мы идентифицировали ген амидазы, кодирующий ферментативно активный фермент, который может вызывать лизис клеток-мишеней.

    Согласно предложенной классификации, стафилококковые фаги делятся на три отличительные категории, определяемые размером их генома. Фаги класса I с наименьшим геномом (<20 кб) относятся к подовирусам, класс II со средним размером генома (~40 кб) – к сифовирусам, а класс III – к миовирусам с самым большим геномом (>125 кб) [20, 52, 53]. ].Размер генома 45  т.п.н. и морфологические свойства фага R4 позволяют предположить, что он относится ко II классу стафилококковых фагов. Это подтверждается модульной структурой генома R4 (рис. 3), что также является характерным для этого класса явлением [53]. В то время как стафилококковые фаги семейства Myoviridae обычно обладают широким кругом хозяев и литическими свойствами, что делает их лучшими кандидатами для целей фаговой терапии [33, 53–56], сифовирусы часто являются умеренными, поскольку они содержат лизогенный модуль (рис. 3, пурпурный).Это вызывает опасения по поводу их использования в качестве терапевтических агентов из-за интеграции в геном хозяина в качестве профага, не вызывая лизиса, и потенциального горизонтального переноса генов между бактериальными геномами. Примечательно, что некоторые факторы вирулентности S. aureus кодируются стафилококковыми профагами [20, 52, 53, 57]. Несмотря на это, экспериментально доказано, что стафилококковые умеренные сифовирусы также могут быть эффективны в качестве противомикробных препаратов против MRSA на моделях мышей [23, 24] с мутированным лизогенным модулем [58, 59].Точечные тесты и изображения ПЭМ (рис. 1) подтвердили, что R4 действительно является литическим фагом.

    Сосредоточив внимание на применении полученных из фагов литических белков, мы можем исключить проблемы, связанные с фаговой терапией в целом. Помимо резистентности, например, даже облигатные литические фаги имеют много белков с гипотетической или неизвестной функцией. Свойства (структура, фармакокинетика и т. д.) рекомбинантного эндолизина могут быть четко определены и лучше контролироваться при производстве антибактериального агента с точки зрения получения чистого агента с подробным однородным составом [60].

    Модульность преобладает в стафилококковых лизинах, обычно состоящих из 2 ферментативно активных (амидаза и CHAP) и консервативного домена, связывающего клеточную стенку Sh4 [21, 35, 36, 61]. Недавно опубликованный эндолизин LysSAP8 фага SAP8 следовал этому признаку [62] и показал многообещающие свойства для использования в качестве антибактериального агента. Наши результаты показали, что новый фаг R4 и его эндолизин R4lys тесно связаны с SAP8 и LysSAP8 соответственно. Результаты поиска по гомологии не показали высокой степени сходства домена CHAP с таким же консервативным сегментом гомологичных белков на N-конце.Тем не менее эндолизин R4lys представляет собой модульный белок с двумя консервативными доменами. Комбинирование разных лизинов с разными сайтами расщепления и их одновременное применение часто приводит к синергизму [21]. Синергетическая активность также может быть достигнута при использовании лизина с некоторыми антибиотиками. Это может быть дополнительно улучшено путем создания химерных слитых белков [61] путем объединения различных доменов с различной специфичностью распознавания клеточной стенки. Наши результаты могут способствовать развитию этих методов.

    5. Выводы

    Наши результаты позволяют предположить, что фаг R4 и его эндолизин, R4lys, могут быть многообещающими кандидатами для дальнейшего исследования фагов.

    Поскольку этот фаг нацелен на международный клон высокого риска, наши результаты могут помочь в разработке терапевтических стратегий на основе бактериофагов для штаммов MRSA и/или VRSA, нацеленных на основные клональные линии.

    Доступность данных

    Данные, использованные для поддержки результатов этого исследования, включены в статью.

    Конфликт интересов

    Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации данной статьи.

    Вклад авторов

    Ботонд Зомбор Пертикс провел очистку фага, анализ диапазона хозяев, генетический анализ, экспрессию белка и клонирование; Dalma Szénásy выполнила анализ зимограммы; Даниэль Дунай провел электронно-микроскопический и генетический анализ; Янник Борн выполнил клонирование; Ларс Физелер выполнил клонирование и экспрессию белка; Тамаш Ковач выполнил секвенирование; Дьёрдь Шнайдер выполнил выделение и координацию фагов.

    Благодарности

    Авторы выражают благодарность д-ру Хайналке Абрахам и профессору д-ру Ласло Шерессу за доступ к установке просвечивающей электронной микроскопии. Настоящий научный труд посвящен 650   году со дня основания Печского университета в Венгрии. Работа выполнена при финансовой поддержке Печского университета [PTE ÁOK-KA-2019-01] и частично Европейского Союза h3020 [SPRING 821423].

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.