Пцр на туберкулез инвитро: Микобактерии туберкулеза, определение ДНК (Mycobacterium tuberculosis, DNA) в сыворотке крови

Микобактерии туберкулеза, определение ДНК (Mycobacterium tuberculosis, DNA) в сыворотке крови

Метод определения ПЦР с детекцией в режиме «реального времени».

Исследуемый материал Сыворотка крови

Доступен выезд на дом

Онлайн-регистрация

Определение ДНК возбудителей туберкулеза, комплекса микобактерий: M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. microti, M. africanum в сыворотке крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме «реального времени».

Туберкулёз (от лат. tuberculum — бугорок) – распространённое, социально зависимое заболевание человека. Болеют им и животные. Возбудитель туберкулёза открыт Р. Кохом в 1882 г. Это кислотоустойчивые аэробные бактерии (74 вида) рода Мycobacterium, широко распространённые в почве, воде и у животных. У человека чаще всего возбудителем является Mycobacterium tuberculosis. Второй по частоте является Mycobacterium bovis. Оба вида очень устойчивы ко многим факторам внешней среды, а в организме очень долго остаются жизнеспособными и могут вызвать заболевание через многие годы после заражения. Очень важно, что микобактерии туберкулёза могут образовывать так называемые L-формы. Сохраняясь в организме, они создают противотуберкулёзный иммунитет.

Длительное время туберкулёз может протекать скрыто и обнаруживаться случайно, хотя нередко уже проявляются такие симптомы, как слабость, быстрая утомляемость, субфебрильная температура, ночная потливость, а в крови – анемия и лейкопения. В настоящее время, несмотря на все достижения антимикробной терапии, туберкулёз угрожает будущему нации. Поэтому все методы диагностики, особенно его латентных форм являются крайне важными.

Существует много методов лабораторной диагностики туберкулёза: микроскопия мазка (чаще всего для этого используют мокроту), классический культуральный метод, ИФА. Всем им присущи достоинства, но и определённые недостатки, в частности, обнаружение микобактерий только в случае их достаточного количества.

В последние годы для диагностики используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Её высокая чувствительность позволяет обнаружить в исследуемом материале единичные клетки и даже их фрагменты ДНК. Метод исключает перекрёстные реакции и специфичность достигает 100%. ПЦР позволяет дифференцировать ограниченные и диссеминированные формы туберкулёза, особенно у детей даже при отрицательных результатах микробиологических исследований.

Аналитические показатели:

  • определяемый фрагмент – специфичные участки ДНК микобактерий;
  • специфичность определения – 100%;
  • чувствительность определения- 100 копий ДНК микобактерий в образце.

Микобактерии туберкулеза, определение ДНК (Mycobacterium tuberculosis, DNA) в мокроте, смывах, лаважной жидкости

Метод определения ПЦР с детекцией в режиме «реального времени».

Исследуемый материал Мокрота, смывы, лаважная жидкость

Доступен выезд на дом

Определение ДНК возбудителей туберкулеза: комплекса микобактерий: M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. microti, M. africanum в мокроте, смывах с бронхов, лаважной жидкости методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме «реального времени.

Туберкулёз (от лат. tuberculum — бугорок) – распространённое, социально зависимое заболевание человека. Болеют им и животные. Возбудитель туберкулёза открыт Р. Кохом в 1882 г. Это кислотоустойчивые аэробные бактерии (74 вида) рода mycobacterium, широко распространённые в почве, воде и у животных. У человека чаще всего возбудителем является Mycobacterium tuberculosis. Второй по частоте является Mycobacterium bovis. Оба вида очень очень устойчивы ко многим факторам внешней среды, а в организме очень долго остаются жизнеспособными и могут вызвать заболевание через многие годы после заражения. Очень важно, что микобактерии туберкулёза могут образовывать так называемые L-формы. Сохраняясь в организме, они создают противотуберкулёзный иммунитет. Длительное время туберкулёз может протекать скрыто и обнаруживаться случайно, хотя нередко уже проявляются такие симптомы, как слабость, быстрая утомляемость, субфебрильная температура, ночная потливость, а в крови – анемия и лейкопения.

В настоящее время, несмотря на все достижения антимикробной терапии, туберкулёз угрожает будущему нации. Поэтому все методы диагностики, особенно его латентных форм являются крайне важными.

Существует много методов лабораторной диагностики туберкулёза: микроскопия мазка (чаще всего для этого используют мокроту), классический культуральный метод, ИФА. Всем им присущи достоинства, но и определённые недостатки, в частности, обнаружение микобактерий только в случае их достаточного количества.

В последние годы для диагностики используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Её высокая чувствительность позволяет обнаружить в исследуемом материале единичные клетки и даже их фрагменты ДНК. Метод исключает перекрёстные реакции и специфичность достигает 100%. ПЦР позволяет дифференцировать ограниченные и диссеминированные формы туберкулёза, особенно у детей даже при отрицательных результатах микробиологических исследований.

Аналитические показатели:

  • определяемый фрагмент – специфические участки ДНК микобактерий;
  • специфичность определения – 100%;
  • чувствительность определения – 100 копий ДНК микобактерий в образце.

Mycobacterium tuberculosis, ДНК [реал-тайм ПЦР]

Исследование для выявления возбудителя туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis), в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) определяется генетический материал (ДНК) микобактерии в образце биоматериала.

Синонимы русские

Туберкулез, микобактерии туберкулеза, палочка Коха.

Синонимы английские

Tuberculosis, Tubercle bacillus, Koch’s bacillus.

Метод исследования

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Биоптат, венозную кровь, ликвор, мокроту, плевральную жидкость, первую порцию утренней мочи, эякулят.

Общая информация об исследовании

Туберкулез (от лат. tuberculum – “бугорок”) – инфекционное заболевание человека и животных, передающееся преимущественно воздушно-капельным путем. Риск заразиться повышает подавление иммунитета, вызванное ВИЧ/СПИДом, диабетом, заболеванием почек, трансплантацией органов и применением иммуносупрессоров, беременностью, старением. Кроме того, наиболее подвержены ему те, кто контактирует с больными туберкулезом, а также дети до 5 лет после виража туберкулиновой пробы. К наиболее уязвимым группам населения относят бездомных, заключенных, мигрантов из стран с высокой заболеваемостью туберкулезом, наркопотребителей, а также пожилых людей.

Для данного исследования используется тест-система, основанная на выявлении геномной ДНК возбудителя туберкулеза с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (реал-тайм ПЦР). В современной диагностике это один из самых быстрых, универсальных и высокочувствительных методов.

Стандартные способы обнаружения микобактерий туберкулеза базируются на выращивании патогенных микроорганизмов в питательной среде. Сложности связаны с низкой скоростью роста колоний Mycobacterium tuberculosis – необходимо ожидать до 1,5 месяцев после взятия материала.

Высокой чувствительностью и специфичностью обладают молекулярно-биологические методы, основанные на детекции генетического материала микобактерий туберкулеза. Их важнейшим преимуществом является высокая скорость получения результата. Использование ПЦР реал-тайм позволяет выявить возбудитель туберкулеза уже в день получения клинического образца.

Бактериемия (попадание в кровь пациента микобактерий) может возникать на ранних стадиях туберкулезной инфекции, а также при развитии генерализованного или внелегочного туберкулеза. Она опасна тем, что иммунный ответ на бактерии вызовет сепсис и септический шок, чреватый смертью. Риск развития генерализованного туберкулеза наиболее высок у пациентов с ВИЧ на поздних стадиях, у тех, кто прервал противотуберкулезную терапию, а также у не обратившихся вовремя за медицинской помощью при появлении симптомов туберкулеза.

Диагностика туберкулеза у ВИЧ-инфицированных затруднена из-за иммуносупрессированного состояния организма, что зачастую проявляется в ложноотрицательных результатах туберкулиновых реакций и микробиологических тестов. В связи с этим тестирование на Mycobacterium tuberculosis методом ПЦР реал-тайм имеет большое значение.

Для чего используется исследование?

  • Для диагностики туберкулеза легких (в частности, его генерализованных и внелегочных, связанных с бактериемией, форм), и контроля за его лечением.

Когда назначается исследование?

  • При подозрении на внелегочный туберкулез.
  • При симптомах бактериемии на фоне туберкулезной инфекции: повышенной температуре тела, потливости и пр. (при небольшом количестве бактерий в крови бактериемия может протекать бессимптомно).
  • Если у пациента был длительный контакт с больным туберкулезом.
  • При ненормальной реакции на туберкулиновую пробу у детей.
  • Когда у пациента ВИЧ-инфекция.

Что означают результаты?

Референсные значения: отрицательно.

Положительный результат

  • Наличие возбудителя в исследуемом биоматериале. Это обычно встречается при активной форме туберкулеза, требующей лечения. Выявление большого количества микобактерий чаще всего указывает на внелегочную форму туберкулеза либо генерализацию инфекции.

Отрицательный результат

  • Возбудителя туберкулеза не выявлено. Бактериемия отсутствует.

Что может влиять на результат?

Эффективная противотуберкулезная терапия со временем приводит к исчезновению микобактерий в клиническом материале.

методы диагностики, какие анализы сдают для выявления туберкулеза?

Эксперты констатируют: туберкулез в России — больше, чем просто болезнь. Это — неприятное социальное клеймо, которое, помимо физических страданий, становится для заболевшего человека источником серьезного психологического дискомфорта, а иногда и вынуждает на долгие месяцы и годы отказаться от привычного образа жизни, карьеры и планов на будущее.

Лечение туберкулеза — процесс сложный и длительный, а успех во многом определяется тем, насколько своевременно было выявлено заболевание. С учетом того, что никто из нас не застрахован от заражения, крайне важно регулярно проходить профилактическое скрининговое обследование, а при малейших подозрениях на недуг — обращаться к уточняющим анализам. Лишь такое ответственное поведение убережет вас от беды.

Когда сдать анализы на туберкулез и почему не стоит с этим медлить

По мнению обывателей, туберкулезом страдают лишь неблагополучные люди, проживающие на грани нищеты, а также выходцы из мест лишения свободы. Однако такой взгляд, как отмечают врачи, не имеет ничего общего с реальностью. Пациентами фтизиатров нередко становятся и учителя, и бизнесмены, и чиновники, и даже сами доктора. Ведь ключевой фактор, приводящий к развитию заболевания, — это отнюдь не финансовое благополучие, а состояние иммунитета. Если по каким-то причинам (стресс, сопутствующее заболевание, беременность, перенесенная операция, погрешности в питании) организм ослаблен — туберкулезная палочка не упустит шанса для атаки.

Важно знать
По статистике в России ежегодно туберкулез выявляют более чем у 80-ти тысяч человек. Каждый третий заболевший погибает от этой болезни. При этом важно понимать, что 90% жителей уже инфицированы — то есть в их легких живет возбудитель заболевания. Но сильный иммунитет не дает болезни развиться, поэтому лишь 1% инфицированных столкнется с какими-либо симптомами туберкулеза.

Болезнь развивается постепенно, начинаясь в лимфатических узлах, а затем распространяясь по органам и тканям организма. Чаще туберкулез поражает легкие, однако в некоторых случаях, а также при отсутствии лечения бактерии размножаются в пищеварительном тракте, органах мочеполовой системы, костях, коже, оболочках головного и спинного мозга и даже в глазах.

Коварная особенность возбудителя заболевания — микобактерии туберкулеза — умение быстро приобретать устойчивость к антибактериальным препаратам, без которых невозможно успешное лечение. Ученые вынуждены разрабатывать все новые и новые лекарства, что в конечном итоге делает терапию дорогой, а также приводит к неизбежным побочным эффектам, таким как поражение печени. Поэтому важным этапом диагностики туберкулеза является определение чувствительности выявленного возбудителя к различным антибиотикам, это помогает врачам подобрать эффективное лечение.

В силу широкого распространения туберкулеза в нашей стране (70% от общего числа российских больных инфекционными и паразитарными заболеваниями умирают именно из-за такого диагноза) выявление зараженных микобактериями среди детей и взрослых организовано достаточно хорошо.

Так, детям и подросткам до 18-ти лет время от времени проводят туберкулиновые пробы, знакомые нам всем как реакция Манту. После достижения совершеннолетия основным методом диагностики становится флюорография, которую каждый гражданин РФ обязан проходить раз в два года, а определенные категории людей — каждый год. Без такого рентгеновского снимка вас, скорее всего, не допустят к работе: результаты флюорографии необходимо предъявлять при трудоустройстве, а в дальнейшем — повторять процедуру в ходе регулярных медосмотров. Таким образом медики стараются минимизировать количество больных туберкулезом, которые не получают лечение и заражают окружающих.

Помимо этих правил, провериться на туберкулез нужно в случаях, если у вас появились симптомы, указывающие на вероятность развития заболевания (слабость, ночное потоотделение, необъяснимая потеря веса, небольшое повышение температуры по вечерам, увеличение лимфоузлов, хронический кашель). Иногда догадка о возможной причине такого недомогания возникает у врача, но вы и сами можете пройти обследование и сдать анализы, чтобы исключить вероятность инфекции.

Какие анализы сдают на выявление микобактерии туберкулеза

Выявить туберкулез можно несколькими путями. Основной задачей диагностики в детском возрасте является определение самого факта инфицирования, ведь в этот период вероятность, что бактерия, попавшая в организм, сразу вызовет патологический процесс, значительно выше, чем у взрослых. По этой причине ведущей методикой первичного скрининга остается туберкулиновая проба.

Оценить признаки поражения легких — наиболее типичное клиническое свидетельство начала заболевания — позволяет флюорография. В случае сомнений для уточняющей диагностики врач назначит рентген — развернутую визуализацию легочной ткани.

Лабораторные анализы крови и мочи помогают «поймать» возбудителя туберкулеза или зафиксировать следы его присутствия в организме. Их назначают для окончательного установления диагноза, а также в целях уточнения степени тяжести заболевания и чувствительности микобактерии к антибиотикам.

Туберкулиновая проба-тест

Туберкулин — это смесь белков, выделенных из погибших возбудителей туберкулеза. Введение небольшого количества такого препарата под кожу вызывает реакцию иммунитета у всех людей, однако в зависимости от состояния их здоровья она проявится по-разному. Так, у пациентов, в организме которых отсутствует микобактерия туберкулеза, через двое суток после пробы останется лишь незначительный след от укола (или его не будет вовсе). Если же размер красной отметины в месте введения туберкулина больше сантиметра или в этой области на коже появился гнойник — высока вероятность, что человек заражен.

Напомним, реакция Манту — метод первичной диагностики, он не может со 100%-ной вероятностью ответить на вопрос, болен ли человек туберкулезом, но позволяет выделить группу риска, которой предстоит пройти дополнительные обследования.

Аппаратные методы диагностики

Поскольку степень инфицирования населения в России микобактериями туберкулеза очень высока, у лиц старше 18-ти лет врачи по умолчанию допускают контакт с инфекцией. Задачей становится поиск больных со скрыто протекающей инфекцией, которые не знают о своем состоянии.

  • Флюорография
    Оптимальным методом массовой диагностики в этом случае была и остается флюорография. Это — фотоснимок экрана рентгеновского аппарата, который можно получить очень быстро, не подвергая при этом человека значительной лучевой нагрузке. Поэтому кабинеты флюорографии есть практически во всех населенных пунктах нашей страны, а пройти процедуру можно за считанные минуты.
  • Рентген и КТ
    В случае если человек не предъявляет никаких жалоб на самочувствие, а флюорография не выявила признаков изменения легочной ткани, врачи делают заключение, что туберкулеза у пациента нет. Но для более тщательной проверки легких может быть назначено развернутое рентгенографическое исследование (когда снимки делаются не только в прямой, но и в боковой проекции, а специалист лучевой диагностики тщательно изучает каждый сантиметр изображения), а также компьютерная томография (КТ), позволяющая с наибольшей степенью достоверности выявить визуальные признаки туберкулеза и оценить степень распространения патологического процесса.

Типы лабораторных анализов на туберкулез

Некоторые из лабораторных анализов, назначаемых при подозрении на туберкулез, являются специфическими — они проводятся только при этом заболевании. Другие же вы можете пройти в рамках общего медицинского осмотра: это ценный источник информации о вашем состоянии здоровья, который способен указать на наличие инфекционного процесса.

  • Общий анализ крови/мочи является диагностическим стандартом при самых разных патологиях. В случае с туберкулезом исследование крови покажет повышение уровня лейкоцитов (сдвиг лейкоцитарной формулы влево) и ускоренную скорость оседания эритроцитов (СОЭ). Изменения в анализе мочи будут наблюдаться при поражении микобактериями почек и мочевыводящих путей — в этом случае в образце обнаружатся признаки амилоидоза.
  • Микроскопия мазка подразумевает поиск возбудителя туберкулеза в отделяемой при кашле жидкости — мокроте. Пациенты с подозрением на заболевание особым образом собирают мокроту в стерильную банку, после чего доставляют анализ в лабораторию. Там частицы мокроты переносят на предметное стекло и окрашивают методом по Цилю-Нильсену (при этом микобактерии туберкулеза приобретают хорошо различимый под микроскопом красный цвет, а большинство остальных микроорганизмов — синий).
  • Классический культуральный метод. Если в ходе микроскопии лаборант выявил в мокроте микобактерии в достаточном количестве (более 5-ти в поле зрения), то следующим этапом лабораторной диагностики туберкулеза становится бактериологический посев образца в питательную среду. Будучи помещенными в оптимальные температурные условия, микроорганизмы быстро растут, что позволяет уточнить их вид и провести оценку чувствительности к различным типам антибиотиков.
  • ИФА (метод иммуноферментного анализа) обнаруживает в крови у пациента антитела к туберкулезу, что указывает на инфицированность (но не обязательно на заболевание). Данный метод подходит в качестве уточняющего шага, а также для диагностики скрыто протекающего и внелегочного туберкулеза.
  • ПЦР (метод полимеразной цепной реакции) выявляет ДНК микобактерий в различных средах — в сыворотке крови, моче, мокроте, спинномозговой жидкости и так далее. Это крайне точный метод, который с достоверностью в 100% может дать ответ на вопрос о том, присутствует ли возбудитель в конкретном органе человека. Чувствительность ПЦР так высока, что в некоторых случаях этот анализ позволяет обнаружить туберкулез даже тогда, когда все другие методики показывают отрицательный результат.
  • Гистологические анализы (биопсия) подразумевают изъятие маленького фрагмента ткани из тела пациента с целью его обстоятельного микроскопического изучения. Биопсия является важным методом диагностики, особенно в ситуациях, когда исследовать биологические жидкости при помощи других анализов не представляется возможным (например, в случае вялотекущего туберкулеза костей).

Диагностика туберкулеза — сложная и крайне ответственная задача, но благодаря развитию современных медицинских технологий получить точную информацию о состоянии здоровья и ответ на вопрос «болею ли я туберкулезом?» — стало доступно каждому. При наличии малейших подозрений на инфекцию — не откладывайте визит к врачу, ведь от вашей сознательности зависит не только прогноз заболевания — но и благополучие окружающих.


Вся информация, касающаяся здоровья и медицины, представлена исключительно в ознакомительных целях и не является поводом для самодиагностики или самолечения.

Сдать анализ на туберкулез в Москве в медицинском центре Медицина

Наименование Цена/руб
Mycobacterium tuberculosis, антитела 500

Ежегодно туберкулез диагностируют более 80 000 россиян, и, вопреки распространенному мнению, далеко не все из них относятся к неблагополучным группам населения. Никто не застрахован от заражения туберкулезом, но вовремя «пойманное» заболевание гораздо проще вылечить.

Для диагностики туберкулеза применяются туберкулиновые тест-пробы, аппаратные и лабораторные методы. Одним из самых точных является анализ крови на туберкулез – чаще всего именно он играет главную роль в окончательной постановке диагноза.

Анализ крови может потребоваться на разных этапах диагностики туберкулеза – в современной медицине применяются следующие его виды:

  • Общий анализ крови: на туберкулез указывает повышенное содержание лейкоцитов и ускоренное оседание эритроцитов. Это один из методов первичной диагностики, являющийся стандартом во многих странах.
  • ИФА (метод иммуноферментного анализа): помогает обнаружить в крови пациента антитела к туберкулезу, которые указывают на инфицированность, даже если заболевание никак не проявляется. Это эффективный метод выявления скрытых и внелегочных форм туберкулеза.
  • ПЦР (полимеразная цепная реакция): выявляет ДНК бактерии в сыворотке крови, т. е. дает гарантированно точную информацию о присутствии туберкулеза в организме. Это самый точный метод диагностирования заболевания, и он срабатывает, когда бессильны все прочие методы. Также этот анализ помогает отличить активную форму болезни от латентной.

Клиника ООО «Медицина» предлагает сдать анализ крови на туберкулез. В нашем распоряжении собственная лаборатория, где вам доступны все виды анализов. При необходимости вы можете обратиться за помощью в лечении заболевания к нашим врачам.


В нашей клинике постоянно проходят Акции


Когда нужен анализ на туберкулез?

Даже если вы, как большинство граждан России, в свое время были привиты вакциной БЦЖ, это не защищает вас от инфицирования. Прививка предотвращает развитие генерализованных форм заболевания и туберкулезного менингита, которые особенно опасны для жизни. От легочного туберкулеза вакцина защищает не так эффективно.

Как уже понятно, туберкулез бывает не только легочным. При заражении другими формами плановые обследования легких не помогут выявить заболевание.

Для плановой диагностики достаточно общего анализа крови, флюорографии и пробы Манту (или Диаскинтеста). Но если у пациента ослабленный иммунитет или имел место длительный контакт с больным, есть смысл провести комплексное обследование.

Наиболее эффективен анализ крови на туберкулез в сочетании с аппаратными методами и тест-пробами. Обращайтесь в клинику ООО «Медицина», чтобы получить исчерпывающую информацию о состоянии своего здоровья!

Мы предлагаем вам высокоточные аппаратные обследования, помощь опытных врачей и следующие преимущества:

  • Удобный график: мы работаем каждый день, оказывая помощь пациентам в выходные и праздничные дни.
  • Выгодные предложения: мы регулярно объявляем скидки и акции на услуги клиники.
  • Удобное расположение: нас легко найти – клиника ООО «Медицина» находится в ЗАО, куда легко добраться из любого района столицы.

 

Анализ крови на антитела к туберкулезу

Анализ крови на антитела к туберкулезуназначают с целью диагностики при подозрении на инфицирование. Исследование методом ИФА позволяет выявить антитела к возбудителю заболевания — микобактериям (палочке Коха).

Туберкулез передается воздушно-капельным путем и нередко протекает скрыто, активизируясь только в 10% случаев. Чаще всего он поражает легкие, в результате чего возникают характерные симптомы:

  • долгий кашель с отхождением мокроты (иногда — крови),
  • подъем температуры тела,
  • слабость и повышенная утомляемость,
  • снижение веса,
  • повышенная потливость в ночные часы.

Различают две формы туберкулеза — открытую и закрытую. В первом случае больной при несоблюдении правил безопасности может стать источником заражения окружающих, во втором — нет.

Подготовка и проведение

Специфической подготовки к процедуре не требуется. Однако анализы крови на антитела к туберкулезу лучше проводить натощак, накануне отказавшись от употребления жирных и жареных блюд.

Для забора биологического материала используют вакуумную систему с активатором свертывания или без антикоагулянта. В лабораторных условиях из цельной крови выделяют сыворотку, которая затем подлежит дальнейшему исследованию.

В норме антитела классов G и M должны отсутствовать. Их обнаружение свидетельствует о наличии текущей инфекции в легких, а также внелегочном туберкулезе (костно-суставном, мочеполовом и др.).

В редких случаях возможны ошибочные реакции.

  • Ложноположительные — при тяжелых ифекционных и соматических болезнях, для которых характерны обширные деструктивные изменения в пораженных органах (например, цирроз печени, онкологические патологии), а также антифосфолипидном синдроме и во время беременности.
  • Ложноотрицательные — после иммуносупрессивной терапии, при некоторых индивидуальных особенностях организма человека и низкой иммуногенности возбудителя.

Анализ крови на антитела используют в комплексной диагностике туберкулеза наряду с рентгенографией, ПЦР, микроскопией мазков мокроты. Специфичность метода достигает 90%. Однократного обнаружения иммуноглобулинов IgG недостаточно для постановки точного диагноза, поэтому после врач назначит дополнительные процедуры.

Где сдать анализ на туберкулез?

Сдать анализ крови на антитела к туберкулезу методом ИФА Вы можете в «Литех». Высокоточное лабораторное оборудование и опыт наших специалистов позволяют получить достоверный результат в максимально короткие сроки. Записаться на анализ крови на туберкулез можно любым удобным способом — по телефону или через интернет-регистратуру.

Все статьи

Медицинские анализы

Медицинские анализы являются основополагающим элементом в постановке любого диагноза.

Именно проведя полноценные исследования можно определить источник и подобрать индивидуальное лечение, которое позволит не только справиться с проблемами, но и поможет избавиться от рецидивов и потенциальных осложнений.

При этом иногда, только лишь направление врача на анализ мочи или направление на анализ крови в Брянске, позволит специалисту быстро определить конкретное заболевание, сконцентрировавшись на его лечении.

Если вам необходимо сдать анализы в Брянске – медицинский центр «Прайм Медикал» поможет вам в этом.

У нас вы сможете сдать анализы на:

  • Кровь на ВИЧ и гепатит
  • Кровь на уровень сахара
  • Кровь на онкологические маркеры
  • Кровь на половые гормоны
  • Исследования иммунной системы
  • Генетические исследования
  • Половые инфекции
  • Определение наркотиков и так далее.

Для получения максимально точных результатов, перед сдачей анализов необходимо за 8-14 часов воздержаться от употребления пищи и жидкостей, за исключением чистой воды.

Категорически запрещается употреблять алкоголь меньше чем за сутки. Также за час до сдачи стоит воздержаться от курения и постараться оградить себя от серьезных стрессов. В случае, если вы принимаете какие-либо лекарственные препараты, стоит посоветоваться с личным врачом, и определить стоит ли сделать перерыв с ними на время сдачи анализов.

Забор анализов (кровь, моча) в лабораторию клиники Прайм Медикал происходит понедельник-пятница с 8:00 до 13:00, суббота с 9:00-12:00. Результаты анализов готовы в тот же день после 16:00.
В лаборатории KDL и ИНВИТРО забор анализов проводится с 8:00 ежедневно (в  процедурном кабинете №4).

Сдать анализы Брянск в нашей клинике – получить надежный результат и доступные цены!

Сдавая анализы в Брянске в клинике «Прайм Медикал» вы сможете рассчитывать на получение результатов в максимально короткий срок. Помимо нашей собственной лаборатории, мы имеем возможность проведения более 1000 видов лабораторных исследований в ведущей лаборатории ИНВИТРО.

Среди них особенно следует выделить анализ на гормоны щитовидной железы, а также ИНВИТРО анализ крови на микроэлементы, бактериологические, иммунологические, гистологические и другие возможные исследования. Наши партнеры обладают лучшим оборудованием и гарантируют надежности своей работы. Данная лаборатория сертифицирована, а их исследования соответствуют государственным медицинским нормативам и ГОСТам.

Цены анализов в Брянске в клинике “Прайм Медикал” доступны и полностью соответствуют прайсу ИНВИТРО. Помимо этого, они подбираются точно в зависимости от потребности каждого конкретного пациента, и помогут врачам медицинского центра определить даже очень редкие заболевания.

Стоимость всех разновидностей анализов для пациентов нашей Клиники полностью соответствует базовому прайс-листу лаборатории ИНВИТРО.

границ | Идентификация Mycobacterium tuberculosis в клинических образцах пациентов с подозрением на внелегочный туберкулез с помощью вложенной ПЦР на пяти различных генах

Введение

Туберкулез (ТБ) — серьезное заболевание, представляющее собой серьезную глобальную проблему общественного здравоохранения во всем мире (Ates Guler et al., 2014). По данным (Всемирной организации здравоохранения, 2014 г.), комплекс Mycobacterium tuberculosis (MTBC) заразил почти одну треть населения мира, и туберкулез остается одной из десяти основных причин смерти в мире.Несмотря на то, что легкие остаются распространенным местом заражения ТБ, во всем мире появляется все больше сообщений о внелегочном туберкулезе (ВЛТБ), что свидетельствует о потенциальной способности распространения M. tuberculosis (MTB) во многих органах тела (Hillemann et al. и др., 2011; да Круз Фурини и др., 2013). ВЛТБ составляет около 15–20% случаев ТБ и может составлять до 50% случаев ТБ у лиц, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) (Mehta et al., 2012). Таким образом, ранние действия по контролю заболевания и вмешательству в цепь передачи требуют точной диагностики и соответствующего лечения (Bollela et al., 1999; Ли, 2015).

В настоящее время технологии на основе нуклеиновых кислот используются для обнаружения MTB с очень высокой чувствительностью и специфичностью (Eisenach et al., 1990), и они могут решить некоторые проблемы, связанные с классическими стандартными лабораторными методами. Микроскопическое исследование кислотоустойчивых бацилл (КУБ), хотя и является быстрым и экономически эффективным, имеет низкую чувствительность и специфичность, особенно в образцах малобактерий, а посев, хотя и считается золотым стандартом из-за его высокой чувствительности, требует нескольких недель для получения результат, а также включает более низкую чувствительность для обнаружения EPTB (Тереза ​​​​и соавт., 2005; да Круз и др., 2011). Поскольку существует множество проблем, связанных с выполнением обычных диагностических методов, для надежного раннего обнаружения и определения вида микобактерий в клинических образцах ВЛТБ разрабатываются различные молекулярно-биологические инструменты, такие как анализы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР в настоящее время является предпочтительным методом идентификации ВЛТБ, так как этот метод является быстрым и оказался чувствительным для обнаружения бактерий в малобациллярных образцах (Chakravorty et al., 2005). Метод ПЦР, позволяющий обнаружить <10 бацилл на миллилитр различных биологических образцов, является полезным инструментом для диагностики MTB (da Cruz et al., 2011). Однако серьезной проблемой обнаружения микобактерий с помощью методов ПЦР является присутствие ингибирующих ПЦР веществ, которые, как обнаружено, в большей степени связаны с ВЛТБ по сравнению с легочными образцами. Наличие ингибиторов во многом связано с переносом в пробоподготовку веществ, препятствующих активности полимеразы.Другие исследователи рекомендовали повторную амплификацию после разбавления ингибиторов для повышения выхода (Alli et al., 2011). Различия в чувствительности являются одним из препятствий, препятствующих полной стандартизации методики ПЦР в лабораториях центров клинического анализа. Чтобы преодолеть эту проблему, ПЦР можно улучшить с помощью ряда модификаций, чтобы иметь возможность обнаруживать небольшое количество бацилл MTB (Meghdadi et al., 2015). В качестве альтернативы, сочетание двух методов ПЦР в форме вложенной ПЦР повысит ее чувствительность и специфичность по сравнению с обычной одиночной ПЦР (da Cruz et al., 2011). Чувствительность вложенной ПЦР по сравнению с обычной одиночной ПЦР уже хорошо задокументирована в нескольких недавних и предыдущих исследованиях (Mishra et al., 2005; da Cruz et al., 2011). В последнем исследовании чувствительность вложенной ПЦР для диагностики MTB была увеличена по сравнению с обычной одиночной ПЦР. В целом, из-за серьезных проблем, связанных с диагностикой ВЛТБ, тщательный отбор нескольких генов-мишеней имеет важное значение для увеличения вероятности обнаружения МТРМЖ в олигобациллярных образцах ВЛТБ (Nisha et al., 2012). Таким образом, настоящее исследование было разработано с целью выявления MTBC в клинических образцах пациентов с подозрением на ВЛТБ. Для более высокого уровня обнаружения для определения частоты EPTB в Ахвазе, Иран, был использован метод вложенной ПЦР, нацеленный на пять различных генов MTBC.

Материалы и методы

Отбор проб и обработка образцов

Всего было получено 100 образцов от случаев с клиническим подозрением на ВЛТБ на основании изображений, клинических данных, гистологических и цитологических наблюдений, поступивших в университетские учебные больницы Университета медицинских наук Ахваза Джундишапура, Иран, в течение 1 года с апреля 2014 г. по апрель 2015 года.Первоначальное предложение по работе было одобрено Высшим объединенным комитетом по исследованиям и этике Университета, и было получено необходимое разрешение на сбор образцов (Этический кодекс.1615 от 21 апреля 2014 г.), а образцы были соответствующим образом деидентифицированы. Типы образцов: 26 лимфатических узлов, 19 биопсий костей, 19 образцов ран, 13 плевральных выпотов, семь образцов мочи, четыре биоптата молочной железы, три спинномозговых жидкости, три синовиальных жидкости, три асцитных жидкости, две биопсии толстой кишки и одна биопсия паращитовидной железы.Стандартное окрашивание на кислотоустойчивые бациллы (КУБ) проводили для образцов в качестве предварительного скринингового теста после необходимой обработки образцов.

ДНК экстрагировали из образцов с помощью набора для подготовки шаблонов для ПЦР высокой чистоты (Roche-Германия). Протокол экстракции жидкостей и образцов тканей был таким же, за исключением выполнения этапа предварительной обработки тканей. Вкратце, 200 мкл буфера для лизиса ткани и 40 мкл протеиназы К добавляли к полностью раздавленному срезу ткани и инкубировали в течение 1 ч при 55°C для полного переваривания.Затем обработанные образцы тканей подвергали экстракции ДНК в соответствии с инструкциями поставщика набора. Экстрагированную ДНК хранили при -20°С до ПЦР-амплификации.

Вложенная полимеразная цепная реакция

Гнездовая ПЦР, нацеленная на пять различных генов IS1081 (Taylor et al., 2007), IS6110 (Marchetti et al., 1998), Hsp65 (Telenti et al., 1993; Velayati 20 4 al., , Mtp40 (Marchetti et al., 1998) и Mpb64 (Therese et al., 2005), МТБ проводили в два этапа с использованием праймеров, перечисленных в таблице 1. Все праймеры были получены от Bioneer Co., Южная Корея. В первой реакции фрагмент ДНК желаемого размера пары оснований (п.н.) для каждого гена амплифицировали с использованием пары внешних праймеров; во второй реакции первый ПЦР-ампликон служил матрицей для гнездовой амплификации фрагмента определенных п.н. в исходной последовательности целевого гена с использованием пары внутренних праймеров. Размер ампликона каждого гена в обеих реакциях гнездовой ПЦР указан в таблице 1 рядом с каждым геном-мишенью.

Таблица 1. Праймеры, использованные для пяти генов-мишеней M. tuberculosis во вложенной ПЦР .

Конечный объем реакции амплификации для первого и второго раундов отдельных генов-мишеней составлял 25 мкл и состоял из 0,2 мМ каждого dNTP, 1,5 мМ MgCl 2 , 0,5 мкМ каждого праймера, 1,5 ЕД ДНК-полимеразы Super Taq™. (Roche, Германия) и 5 ​​мкл матричной ДНК. Условия ПЦР были следующими: начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 30 циклов денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг соответствующих праймеров при соответствующей температуре (табл. 1) в течение 30 с, удлинение при 72 °С в течение 30 с и окончательное удлинение при 72°С в течение 4 мин.Во второй реакции (гнездовой) продукт ПЦР первого раунда разбавляли (в 100 раз для генов IS6110, mpb64 и в 200 раз для генов IS1081, hsp65 и mtp40 ) и использовали в качестве матрицы. во второй реакции (вложенной). Программа циклирования для вложенной реакции была такой же, как и для первой, за исключением того, что количество циклов было увеличено до 35. Продукты ПЦР анализировали с помощью гель-электрофореза на 2% агарозе в 1X ТАЕ-буфере, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия, и визуализировали с помощью системы документации гелей (Proteinsimp, США).

Для анализа данных использовали программное обеспечение

SPSS (SPSS Inc., № 13). Тест обобщенного оценочного уравнения (GEE) применялся для исследования корреляционных и статистических взаимосвязей между применяемыми методами.

Результаты

В настоящем исследовании проанализированные клинические образцы были получены от 46 мужчин и 54 женщин, большинство из которых находились в возрастной группе 41–60 лет. Лимфатические узлы были наиболее частыми образцами (26%), за ними следовали биопсии костей и выделения из раны, каждая по 19%.Тринадцать образцов (13%) были положительными при окрашивании КУМ, в то время как при применении гнездовой ПЦР, нацеленной на 5 генов MTB, 26 образцов (26%) показали положительные результаты.

Для настройки и оптимизации вложенной ПЦР, 10 образцов (плевральный выпот, мокрота и спинномозговая жидкость) от случаев клинического ТБ, подтвержденных культуральными и биохимическими тестами и ПЦР в реальном времени, и 10 образцов от подтвержденных нетуберкулезных случаев (колонии от не- микобактериальные бактерии, включая Pseudomonas, E. coli и Staphylococci) были включены в исследование.Эти контрольные образцы прошли те же этапы обработки, что и тестируемые образцы. Все образцы положительного контроля показали положительные результаты для всех протестированных генов, в то время как ни один из образцов отрицательного контроля не показал положительных результатов в гнездовой ПЦР ни с одним из генов. Общий уровень положительных результатов для протестированных генов был следующим: IS6110 (22%), IS1081 (24%), hsp65 (21%), mbp64 (12%) и mtp40 (22%). (Таблица 2).

Таблица 2.Сравнение результатов гнездовой ПЦР среди образцов EPTB с различными генами-мишенями .

Результаты окрашивания КУМ и гнездовой ПЦР по отношению к клиническим образцам представлены в таблице 3, и, поскольку она показывает самый высокий уровень положительных результатов для образцов лимфатических узлов и ЦСЖ, был получен с помощью IS6110 (23,1%) и hsp65 ( 33,3%) генов соответственно. Для образцов костей (26,3%) и мочи (14,3%) гены IS1081 и mtp40 показали более положительные результаты, а в ране (36.8%) и множественных выпотов (30,8%), наибольшая положительная частота была продемонстрирована с геном IS1081 . Так, наибольшая положительная частота в гнездовой ПЦР была достигнута с геном IS1081 (24%), а наименьшая — с геном mpb64 (12%). Для образцов мочи и спинномозговой жидкости положительные результаты были получены только для двух из пяти протестированных генов, и ни один из образцов молочной железы, синовиальной жидкости или толстой кишки не показал положительных результатов окрашивания КУМ или любого из протестированных генов в гнездовой ПЦР.На рисунке 1 представлены положительные результаты амплификации генов-мишеней.

Таблица 3. Общий положительный показатель мазка и гнездовой ПЦР с использованием пяти различных генов-мишеней M. tuberculosis в зависимости от типа внелегочных образцов .

Рисунок 1. Электрофорез продуктов ПЦР на 2% агарозном геле . M, маркер молекулярного размера; дорожки 1, 2, фрагмент 439 п.н. гена hsp65 ; дорожки 3, 4, 223 п.н. фрагмент гена mtp40 ; дорожки 5, 6, фрагмент 248 п.н. гена IS1081 ; дорожки 7, 8, фрагмент 123 п.н. гена IS6110 ; Дорожки 9, 10, фрагмент 200 п.н. mpb64 гена .

В этом исследовании проведено сравнение результатов окрашивания КУМ и гнездовой ПЦР (таблица 3). Мы продемонстрировали небольшое улучшение результатов в лимфатических узлах с помощью ПЦР, ориентированной на гены IS6110 – и hsp65 по сравнению с окрашиванием КУМ. Тем не менее, выходы асцитической жидкости и плеврального выпота не были существенно улучшены с помощью ПЦР, но выходы из костей и ран были, как и в гнездовой ПЦР с использованием любого гена, для асцитической жидкости была получена такая же частота положительных результатов (33,3%).В то время как для образцов плеврального выпота только ПЦР на основе IS1081 показала одинаковую долю положительных результатов с окрашиванием КУМ (30,8%). Однако результаты для образцов костей и ран продемонстрировали улучшенный выход, главным образом, за счет использования гена IS1081 .

Статистический анализ с использованием теста GEE по результатам гнездовой ПЦР не выявил существенных различий в частоте положительных результатов по генам IS6110, hsp65, IS1081 и mtp40 ( P > 0,05), в то время как достоверные различия были обнаружены между положительными скорость, достигнутая геном mbp64 , в отличие от других протестированных генов (таблица 4), и результаты окрашивания AFB (таблица 5).

Таблица 4. Значение корреляции между геном mbp64 и другими генами-мишенями в вложенной ПЦР .

Таблица 5. Значение корреляции между результатами мазка КУМ и результатами вложенной ПЦР, направленной на пять различных генов .

Обсуждение

Диагноз ВЛТБ всегда сталкивается с проблемами, связанными с отбором образцов, поскольку сбор некоторых образцов, таких как множественный выпот или биопсия костей, требует инвазивного и трудоемкого процесса.Обычно это приводит к отсутствию адекватного сбора образцов, необходимых для обработки. По этой причине образец должен одновременно подвергаться различным диагностическим исследованиям, таким как гистология, микробиология, биохимический анализ и ПЦР. Иногда, даже в случае микробиологического анализа, количество микроорганизмов в образце недостаточно или не распределено достаточно равномерно для надежного обнаружения. В настоящей работе для выделения ДНК мы использовали набор для экстракции и очистки высокой степени чистоты, чтобы свести к минимуму ингибиторы в EPTB.Кроме того, в гнездовой ПЦР использовали разведение продукта первой реакции ПЦР, что эффективно снижало концентрацию остальных ингибирующих веществ. Однако, поскольку для вложенной ПЦР также были получены как ложноотрицательные, так и положительные результаты (Sinha et al., 2016), использование нескольких мишеней в ПЦР повысит выход и устранит ложноположительные или отрицательные результаты, которые чаще встречаются в случае одного целевого гена. Спектакль ПЦР. В настоящем исследовании для исключения ложных результатов мы одновременно использовали контроли подтвержденных и нетуберкулезных случаев.Мы получили положительные результаты гнездовой ПЦР для всех подтвержденных случаев ТБ со всеми протестированными генами.

Несколько факторов могут влиять на относительную чувствительность генов-мишеней. Пауцибациллярный характер образцов EPTB является проблемой, влияющей на выход ПЦР. Другое дело — количество копий генов-мишеней в геноме МТБ. Хотя в молекулярных исследованиях MTB обычно предпочтительными мишенями являются IS6110 и IS1081 из-за более высокого числа копий этих генов в бактериальном геноме, однако в случае IS6110 имеются сообщения о штаммах с низким числом копий ( Санкар и др., 2011). С другой стороны, при определенных обстоятельствах ген с меньшим числом копий не мог быть обнаружен с помощью вложенной ПЦР, несмотря на усовершенствование метода.

Таким образом, в этом исследовании, используя пять различных генов-мишеней IS6110, IS1081, hsp65, mbp64 и mtp40 , мы попытались получить больше положительных результатов и продемонстрировали 22, 24, 21, 12 и 22% положительных результатов. для образцов ЭПТБ соответственно. Гнездовая ПЦР, нацеленная на ген IS1081 , показала большую чувствительность по сравнению с другими протестированными генами.Ранее Фатолахзаде и соавт. (2007) из Ирана успешно использовали IS1081 – ПЦР для выявления туберкулеза легких, и 78,2% их изолятов дали положительные результаты.

Для образцов спинномозговой жидкости мы получили 33,3% положительных результатов при использовании генов IS6110 или hsp65 . Хотя исследование Sastry and Sandhya Bhat (2013) в Индии, которое проводилось на образцах ЦСЖ с использованием IS6110 -гнездовой ПЦР, было достигнуто 40,3% положительных результатов, что было выше, чем наши результаты, вероятно, из-за большего размера их выборки, поскольку количество образцов спинномозговой жидкости в этом исследовании было слишком мало, чтобы делать какие-либо выводы.Также Альфонсо и др. (2002) в Колумбии сообщили о 74% положительных результатов при применении вложенной ПЦР с целью mtp40 на клинических образцах (моча, мокрота, спинномозговая жидкость и т. д.), в то время как в настоящем исследовании 22% образцов были положительными при использовании mtp40. генов. Причина может заключаться в включении в их работу как легочных, так и внелегочных препаратов, что повышает положительный показатель, так как работа с легочными образцами намного проще по сравнению с внелегочными образцами.

Что касается гена mpb64 в качестве мишени в гнездовой ПЦР, мы получили 12% положительных результатов.Тереза ​​и др. (2005) в Индии сообщили о 43,4% положительных результатах использования того же гена в гнездовой ПЦР на различных образцах с подозрением на ВЛТБ, и они сообщили, что этот ген является чувствительной мишенью для диагностики МТБ в образцах ВЛТБ. Однако наши результаты продемонстрировали самый низкий уровень положительных результатов для этого гена, представляющего более низкую чувствительность по сравнению с другими генами-мишенями.

Сравнение первой и второй реакций гнездовой ПЦР показало, что результаты первой реакции, которая фактически является представителем классической ПЦР, продемонстрировали меньшую положительную реакцию по сравнению со второй реакцией для всех тестируемых генов, с наибольшей разницей в частоте положительных результатов для mtp40. , улучшение с 16 до 22%.Таким образом, результаты этого исследования показали, что метод гнездовой ПЦР имеет более высокую чувствительность по сравнению с традиционным методом ПЦР для обнаружения генома MTB в образцах из EPTB. Наши результаты согласуются с другими исследованиями, в которых подчеркивается превосходство гнездовой ПЦР над обычной ПЦР в диагностике MTB (Marchetti et al., 1998; da Cruz et al., 2011). В этом исследовании из общего числа образцов с подозрением на ВЛТБ 26% образцов были положительными по крайней мере для одного из протестированных генов по сравнению с контрольными образцами с подтвержденным туберкулезом и без него.Таким образом, на молекулярном уровне частота ВЛТБ в наших условиях определяется как 26%, в отличие от более низкой частоты, полученной при окрашивании КУМ (13%).

В заключение, здесь мы сообщаем о более высокой частоте обнаружения EPTB в клинических образцах с использованием пяти различных целевых генов MTB. Этот подход с вложенной ПЦР облегчает сравнение и выбор наиболее часто обнаруживаемых генов. Конечно, это исследование продемонстрировало приоритет IS1081 , за которым следуют mtp40 и IS6110 , среди пяти протестированных генов и указывает на эффективность любого из трех генов в дизайне эффективного теста гнездовой ПЦР, который облегчает раннее исследование. диагностика малобациллярных случаев ВЛТБ, которые трудно диагностировать имеющимися стандартными методами.Однако, поскольку для некоторых типов образцов, таких как спинномозговая жидкость, асцит или синовиальная жидкость, количество проанализированных образцов было небольшим, в будущих исследованиях потребуется больше образцов для изучения эффективности генов-мишеней в диагностике. Кроме того, можно было бы провести лучшее сравнение с результатами окрашивания фенотипических КУМ.

Вклад авторов

AK и AH: Существенный вклад в концепцию, дизайн работы; Окончательное утверждение версии для публикации; Согласие нести ответственность за все аспекты работы, обеспечивая надлежащее расследование и решение вопросов, связанных с точностью или достоверностью любой части работы.АА: Сбор, анализ, интерпретация данных для работы; Согласие нести ответственность за все аспекты работы, обеспечивая надлежащее расследование и решение вопросов, связанных с точностью или достоверностью любой части работы. HM: Сбор, анализ, интерпретация данных для работы; Окончательное утверждение версии для публикации.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Эта работа является частью MSc. диссертация Амене Алами, которая была одобрена в Исследовательском центре инфекционных и тропических заболеваний и получила финансовую поддержку в виде гранта (№ A-1615) от отдела исследований Университета медицинских наук Ахваза Джундишапура, Ахваз, Иран.

Ссылки

Альфонсо Р., Ромеро Р. Э., Патарройо М. Э. и Мурильо Л. А. (2002). Амплификация фрагмента гена Mtp-40 и альфа-антигена для обнаружения Mycobacterium tuberculosis в колумбийских клинических образцах. Мем. Инст. Освальдо Круз 97, 1157–1163. дои: 10.1590/S0074-02762002000800017

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Алли, О.А., Огболу, О.Д., и Алака, О.О. (2011). Прямое молекулярное выявление комплекса Mycobacterium tuberculosis из клинических образцов – дополнение к культуральному методу лабораторной диагностики туберкулеза. Сев. Ам. Дж. Мед. науч. 3, 281–288. doi: 10.4297/najms.2011.3281

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Атес Гулер, С., Bozkus, F., Inci, M.F., Kokoglu, O.F., Ucmak, H., Ozden, S., et al. (2014). Оценка легочного и внелегочного туберкулеза у иммунокомпетентных взрослых: ретроспективный анализ серии случаев. Мед. Принц. Практика. 24, 75–79. дои: 10.1159/000365511

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Боллела В.Р., Сато Д.Н. и Фонсека Б.А. (1999). Проблемы стандартизации полимеразной цепной реакции для диагностики туберкулеза легких. Rev. Saude Publica. 33, 281–286. дои: 10.1590/S0034-8

900009

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чакраворти, С., Сен, М.К., и Тьяги, Дж.С. (2005). Диагностика внелегочного туберкулеза по мазку, культуре и ПЦР с использованием универсальной технологии обработки образцов. Дж. Клин. микробиол. 43, 4357–4362. doi: 10.1128/JCM.43.9.4357-4362.2005

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

да Круз, Х.Л.А.Д., Черногория, Р.Д.А., Лима, Дж.Ф.Д.А., Порока, Д.Д.Р., Лима, Дж.Ф.Д.С., Черногория, Л.М.Л., и др. (2011). Оценка гнездовой ПЦР для обнаружения Mycobacterium tuberculosis в образцах крови и мочи. Браз. Дж. Микробиол. 42, 321–329. дои: 10.1590/S1517-83822011000100041

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

da Cruz Furini, A.A., Pedro, H.D.S.P., Rodrigues, J.F., Montenegro, L.M.L., Machado, R.L.Д., Франко С. и др. (2013). Обнаружение комплекса Mycobacterium tuberculosis методом гнездовой полимеразной цепной реакции в легочных и внелегочных образцах. Дж. Брас. пневмол. 39, 711–718. дои: 10.1590/S1806-37132013000600010

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Эйзенах, К.Д., Кейв, М.Д., Бейтс, Дж.Х., и Кроуфорд, Дж.Т. (1990). Амплификация с помощью полимеразной цепной реакции повторяющейся последовательности ДНК, специфичной для Mycobacterium tuberculosis . Дж. Заразить. Дис. 161, 977–981. doi: 10.1093/infdis/161.5.977

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Фатолахзаде, Б., Малекнеджад, П., Бахадор, А., Пири-Догахе, Х., Алихани, М.Ю., и Радманеш-Ахсани, Р. (2007). Оценка различных наборов праймеров для экспресс-диагностики туберкулеза. пак. Дж. Биол. науч. 10, 107–111. doi: 10.3923/pjbs.2007.107.111

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хиллеманн, Д., Рюш-Гердес, С., Беме, К., и Рихтер, Э. (2011). Быстрое молекулярное выявление внелегочного туберкулеза с помощью автоматизированной системы GeneXpert MTB/RIF. Дж. Клин. микробиол. 49, 1202–1205. doi: 10.1128/JCM.02268-10

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Маркетти Г., Гори А., Катоцци Л., Ваго Л., Небулони М., Росси М. С. и др. (1998). Оценка ПЦР при обнаружении Mycobacterium tuberculosis в фиксированных формалином и залитых парафином тканях: сравнение четырех анализов амплификации. Дж. Клин. микробиол. 36, 1512–1517.

Реферат PubMed | Академия Google

Мегдади, Х., Хосрави, А.Д., Гадири, А.А., Сина, А.Х., и Алами, А. (2015). Обнаружение Mycobacterium tuberculosis в образцах внелегочной биопсии с использованием ПЦР, нацеленной на IS6110, rpoB и ПЦР-клонирование вложенных rpoB. Фронт. микробиол. 6:675. doi: 10.3389/fmicb.2015.00675

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мехта, П.К., Радж А., Сингх Н. и Хуллер Г.К. (2012). Диагностика внелегочного туберкулеза методом ПЦР. ФЭМС Иммунол. Мед. микробиол. 66, 20–36. doi: 10.1111/j.1574-695X.2012.00987.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мишра А., Сингхал А., Чаухан Д. С., Каточ В. М., Шривастава К., Такрал С. С. и соавт. (2005). Прямое обнаружение и идентификация Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis в образцах крупного рогатого скота с помощью нового метода гнездовой ПЦР: корреляция с традиционными методами. Дж. Клин. микробиол. 43, 5670–5678. doi: 10.1128/JCM.43.11.5670-5678.2005

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ниша А., Говиндараджан С., Мутурадж М., Мануприя С., Ушарани Б., Каматчьяммал С. и др. (2012). Молекулярная характеристика гена rpoB, кодирующего субъединицу РНК-полимеразы b, в устойчивых к рифампину штаммах Mycobacterium tuberculosis из южной Индии. фр. Дж. Биотехнология. 11, 3160–3168. дои: 10.5897/AJB10.449

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Санкар С., Куппанан С., Балакришнан Б. и Нандагопал Б. (2011). Анализ разнообразия последовательностей среди последовательностей IS6110 Mycobacterium tuberculosis : возможные последствия для обнаружения на основе ПЦР. Биоинформация 6, 283–285. дои: 10.6026/97320630006283

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Шастри, А.С., и Сандхья Бхат, К.К. (2013). Диагностическая полезность Bact/ALERT и вложенной ПЦР в диагностике туберкулезного менингита. Дж. Клин. Диагн. Рез. 7, 74–78. doi: 10.7860/jcdr/2012/5098.2674

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Синха П., Гупта А., Пракаш П., Анупурба С., Трипати Р. и Шривастава Г. Н. (2016). Дифференциация комплекса Mycobacterium tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий с помощью гнездовой мультиплексной ПЦР, нацеленной на фрагменты гена, кодирующие IS6110, MTP40 и альфа-антиген 32 кДа. BMC Заражение. Дис. 16:123. doi: 10.1186/s12879-016-1450-1

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Тейлор, Г.М., Уорт, Д.Р., Палмер, С., Джаханс, К., и Хьюинсон, Р.Г. (2007). Быстрое обнаружение ДНК Mycobacterium bovis в лимфатических узлах крупного рогатого скота с видимыми поражениями с помощью ПЦР. BMC Вет. Рез. 3:12. дои: 10.1186/1746-6148-3-12

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Теленти, А., Маркези, Ф., Бальц, М., Франк, Б., Ботргер, Э.С., и Бодмер, Т. (1993). Быстрая идентификация микобактерий до видового уровня с помощью полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа. Дж. Клин. микробиол. 31, 175–178.

Реферат PubMed | Академия Google

Тереза, К.Л., Джаянти, У., и Мадхаван, Х.Н. (2005). Применение вложенной полимеразной цепной реакции (nPCR) с использованием праймеров гена MPB 64 для обнаружения ДНК Mycobacterium tuberculosis в клинических образцах от пациентов с внелегочным туберкулезом. Indian J. Med. Рез. 122, 165–170.

Реферат PubMed | Академия Google

Велаяти, А. А., Фарния, П., Мозафари М., Малекшахян Д., Сейф С., Рахидех С. и др. (2014). Молекулярная эпидемиология изолятов нетуберкулезных микобактерий из клинических и экологических источников мегаполиса. PLoS ONE 9:e114428. doi: 10.1371/journal.pone.0114428

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Всемирная организация здравоохранения (2014 г.). Глобальный отчет о туберкулезе . Женева: Всемирная организация здравоохранения.

Ошибка страницы — BD

Возможности Пожалуйста, выберитеДоставка анестезииБиопсияБионаукиБиохирургияСкрининг рака шейки маткиУход за диабетомСистемы доставки лекарствБезопасность опасных лекарств Лечение и фиксация грыжиПрофилактика инфекцийИнфузионная терапияСпециализированные вмешательстваЛабораторная автоматизацияЛекарства и управление поставкамиМикробиологические решенияМолекулярная диагностикаМониторинг пациентов и управление температуройРешения для утилизации острых предметовМультиомика отдельных клетокПрограммные решенияСбор образцовХирургические инструментыШприцы и иглыСосудистый доступ

Линейка продуктов Пожалуйста выберите

Пожалуйста, выберитеИглы и шприцы для анестезииBD Intelliport™ Medication Management SystemПодносы для регионарной анестезииБиопсия костиБиопсия молочной железыБиопсия сигнального лимфатического узлаБиопсия мягких тканейBD Accuri™ C6 PlusBD FACS™ Lyse Wash AssistantBD FACS™ Sample Prep Assistant (SPA) IIIBD FACSAria™ FusionBD FACSCalibur™BD FACSCanto™BD FACSCanto™ IIBD FACSCelesta ™BD FACSCount™BD FACSJazz™BD FACSLyric™BD FACSMelody™BD FACSVerse™BD FACSVia™BD FACSymphony™BD LSRFortessa™BD LSRFortessa™ X-20BD™ Medimachine SystemГемостатыГемостатыСбор цервикальных образцов Цитологические инструментыНегинекологическая цитологияBD FlowSmart technologyИнсулиновые шприцыPenharmac Технологии для сдерживания инъекцийОстрые предметыПоддержка услугиПреднаполняемые шприцевые системыЗащитные и защитные системыСистемы самоинъекцииСистема BD Rhapsody™ ExpressСистема BD Rhapsody™Система BD Single-Cell Multiplexing kitСистема BD HD CheckСистема BD PhaSeal™СистемаTexium™Биологические грыжевые трансплантатыБиорезорбируемая сеткаФиксацияСинтетика сеткаBD ChloraShield™ внутривенная повязкаChloraPrep™ хирургический аппликаторChloraPrep™ сосудистый аппликаторStartCleanХирургические ножницыХирургические скрабы для рукПодносы, щетки и растворы для сыпучих материаловСистема Alaris™BD Insyte™ Autoguard™ Экранированный катетер для внутривенных вливаний с технологией контроля кровиЗакрытая катетерная система Nexiva™ для внутривенных вливанийBD Nexiva™ Diffusics™ Закрытая катетерная система для внутривенных вливанийBD Saf-T Закрытая катетерная система Intima™Комплекты удлинителей для внутривенных вливанийКомплекты для внутривенного введения гравитационные и вторичные комплекты для внутривенных вливанийРастворы для внутривенного введенияИнфузионное средство просмотраПортал знаний для инфузионной системы Alaris™Комплекты и аксессуары MaxPlus™ для внутривенных вливанийБезыгольные коннекторыMaxZero™Безыгольные коннекторыSmartSite™Denver™ шунтыБиопсия костного мозга Jamshidi™Катетерная дренажная система PleurX™Safe-T™ PLUS Диагностические и процедурные лоткиБиопсия мягких тканейУстройства для торакоцентеза/парацентезаОбработчик образцов BD Kiestra™ InoqulA™+Система TLA BD Kiestra™Система BD Kiestra™ WCABD Pyxis™ IV PrepKnowledge Portal for Pyxis™ Medication TechnologiesПортал знаний для Pyxis™ Supply TechnologiesPyxis™ Medicine te технологииПериоперационные решенияBD Pyxis™ Периоперационные решенияPyxis™ Point of Care VerificationPyxis™ Supply TechnologiesПосев кровиКультуральные средыСистемы защиты окружающей средыИдентификация и тестирование чувствительностиПромышленная микробиологияЛабораторное оборудование и расходные материалыТестирование на микобактерииТестирование в месте оказания медицинской помощиСерологическое тестированиеПятна и реагентыСбор образцов на основе мазков Сбор кровиМолекулярные системыМолекулярные тестыЦелевое управление температуройBD Recykleen™ для сбора острых предметов и принадлежностей сборщики отходовАксессуары для сбора острых предметовПортал знаний для инфузионной системы Alaris™Портал знаний для медицинских технологий Pyxis™Портал знаний для технологий снабжения Pyxis™Клинический консультант и консультант по инфекциям BD HealthSight™Аксессуары для сбора BD Vacutainer®Сбор крови Сбор образцов на основе мазковСбор образцов мочиСтерилизационные контейнеры Genesis™Система отслеживания инструментов IMPRESS™Snowden-Pencer™ лапароскопическая ИнструментыИнструменты для аспирации и ирригацииПереливание крови инструментыВ.Мюллер ™ Иглы хирургического InstrumentsAlternate siteAnesthesia и syringesBD PosiFlush ™ Предварительно заполненные SyringesConventional игла и syringesEnteral и оральные иглы syringesSafety и syringesBD ChloraShield ™ IV dressingIntraosseous сосудистого доступ systemsIV уход и устройства maintenancePort и needlesVascular И.В. cathetersAngioplastyArterial болезнь testingAtherectomyCarotid shuntsValvuloplastyVascular graftsVascular occlusionVascular sheathsVascular стентирования

Особенности подхода, мазок мокроты, тесты на амплификацию нуклеиновых кислот

Автор

Томас Э. Херчлайн, доктор медицины  , профессор медицины, Государственный университет Райта, Медицинская школа Бунсхофта; Медицинский консультант, общественное здравоохранение, Туберкулезная клиника округа Дейтон и Монтгомери (Огайо)

Томас Э. Херчлайн, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Alpha Omega Alpha, Общество инфекционных заболеваний Америки, Общество инфекционных заболеваний штата Огайо

Раскрытие информации: Получен исследовательский грант от: Regeneron.

Соавтор (ы)

Джудит К. Амороза, доктор медицины, FACR  Клинический профессор радиологии и заместитель председателя по развитию факультета и медицинскому образованию, Медицинская школа имени Роберта Вуда Джонсона в Рутгерсе

Джудит К. Амороза, доктор медицины, FACR является членом следующих медицинских обществ: Американский колледж радиологии, Американское общество рентгеновских лучей, Ассоциация университетских рентгенологов, Радиологическое общество Северной Америки, Общество торакальной радиологии

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Главный редактор

Майкл Стюарт Бронз, доктор медицины  Дэвид Росс Бойд Профессор и заведующий кафедрой медицины Стюарта Г. Вольфа, кафедра внутренних болезней, медицинский факультет Центра медицинских наук Университета Оклахомы; магистр Американского колледжа врачей; член Американского общества инфекционистов; Член Королевского колледжа врачей, Лондон,

. Майкл Стюарт Бронз, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Альфа-Омега-Альфа, Американский колледж врачей, Американская медицинская ассоциация, Ассоциация профессоров медицины, Американское общество инфекционных заболеваний, Медицинская ассоциация штата Оклахома, Южное общество клинических исследований

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Благодарности

Erica Bang Университет штата Нью-Йорк Медицинский центр Даунстейт Медицинский колледж

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Диана Брейнард, MD Консультирующий персонал, Отделение инфекционных заболеваний, Массачусетская больница общего профиля

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Памела С. Чавис, MD Профессор кафедры офтальмологии и неврологии, Медицинский университет Южной Каролины, Медицинский колледж

Памела С. Чавис, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Американской академии неврологии, Американской академии офтальмологии и Североамериканского общества нейроофтальмологии

.

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Дирк М. Элстон, MD Директор Академии дерматопатологии Аккермана, Нью-Йорк

Дирк М. Элстон, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Американская академия дерматологии

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Теодор Дж. Гаэта, DO, MPH, FACEP Клинический адъюнкт-профессор, отделение неотложной медицины, Медицинский колледж Вейла Корнелла; заместитель председателя и программный директор резидентуры по неотложной медицинской помощи, отделение неотложной медицинской помощи, Нью-Йоркская методистская больница; Академический председатель, адъюнкт-профессор, отделение неотложной медицины, Медицинский факультет Университета Святого Георгия

Теодор Дж. Гаэта, DO, MPH, FACEP является членом следующих медицинских обществ: Альянс клинического образования, Американский колледж врачей скорой помощи, Директора клерков по неотложной медицине, Совет директоров резидентур по неотложной медицине, Нью-Йоркская медицинская академия и Общество академической неотложной медицины

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Аарон Глатт, доктор медицины Профессор клинической медицины Нью-Йоркского медицинского колледжа; Президент и главный исполнительный директор, бывший главный врач отделения медицины и инфекционных заболеваний больницы Св. Иосифа (бывшая больница Нью-Айленд)

Аарон Глатт, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Американского колледжа пульмонологов, Американского колледжа врачей-руководителей, Американского колледжа врачей, Американского колледжа врачей-Американского общества внутренних болезней, Американской медицинской ассоциации, Американского общества микробиологии. , Американское торакальное общество, Американская ассоциация венерических заболеваний, Американское общество инфекционных заболеваний, Международное общество по СПИДу и Американское общество медицинской эпидемиологии

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Simon K Law, MD, PharmD Клинический профессор медицинских наук, кафедра офтальмологии, Глазной институт Жюля Штейна, Калифорнийский университет, Лос-Анджелес, Медицинская школа Дэвида Геффена

Simon K Law, MD, PharmD является членом следующих медицинских обществ: Американской академии офтальмологии, Американского общества глаукомы и Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии

.

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

John M Leedom, MD Почетный профессор медицины Медицинской школы Кека Университета Южной Калифорнии

John M Leedom, MD, является членом следующих медицинских обществ: Alpha Omega Alpha, Американский колледж врачей-Американское общество внутренних болезней, Американское общество микробиологии, Американское общество инфекционных заболеваний, Международное общество по СПИДу и Phi Beta Kappa

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Джеймс Ли, доктор медицинских наук Бывший доцент отделения неотложной медицины Гарвардской медицинской школы; Совет директоров, Дистанционная медицина

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Джеффри Мефферт, MD Ассистент клинического профессора дерматологии Медицинской школы Техасского университета в Сан-Антонио

Джеффри Мефферт, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Американской академии дерматологии, Американской медицинской ассоциации, Ассоциации военных дерматологов и Техасского дерматологического общества

.

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Монте С. Мельцер, MD Начальник дерматологической службы, Union Memorial Hospital

Монте С. Мельцер, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Alpha Omega Alpha и Американской академии дерматологии

.

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Susannah K Mistr, MD Врач-резидент, отделение офтальмологии, Медицинский центр Университета Мэриленда

Susannah K Mistr, MD, является членом следующих медицинских обществ: Американская академия офтальмологии, Американский колледж хирургов, Американская медицинская ассоциация, Американская ассоциация студентов-медиков/Фонд, Американское общество катарактальной и рефракционной хирургии и Медицинская ассоциация Южной Каролины

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Кэрол А. Нэйси, доктор философии Адъюнкт-профессор кафедры биологии Католического университета Америки; Адъюнкт-профессор кафедры тропической медицины и микробиологии Университета Джорджа Вашингтона

Кэрол Нэйси, доктор философии, является членом следующих медицинских обществ: Американской академии микробиологии и Американского общества микробиологии

.

Раскрытие информации: Sequella, Inc. Доля участия Занятость; Sequella, Inc. Долевой инвестор

Дж. Джеймс Роуси, доктор медицины , бывший директор службы роговицы, Институт катаракты и лазера Святого Луки

J James Rowsey, MD, является членом следующих медицинских обществ: Американская академия офтальмологии, Американская ассоциация содействия развитию науки, Американская медицинская ассоциация, Ассоциация исследований в области зрения и офтальмологии, Медицинская ассоциация Флориды, Панамериканская ассоциация офтальмологов. , Sigma Xi и Южная медицинская ассоциация

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Hampton Roy Sr, MD Адъюнкт-профессор, кафедра офтальмологии, Арканзасский университет медицинских наук

Хэмптон Рой-старший, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Американской академии офтальмологии, Американского колледжа хирургов и Панамериканской ассоциации офтальмологов

.

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

John D Sheppard Jr, MD, MMSc Профессор офтальмологии, микробиологии и молекулярной биологии, клинический директор Центра офтальмологической фармакологии Томаса Р. Ли, ординатура по офтальмологии, директор исследовательской программы Медицинской школы Восточной Вирджинии; Президент Virginia Eye Consultants

John D Sheppard Jr, MD, MMSc является членом следующих медицинских обществ: Американская академия офтальмологии, Американское общество микробиологии, Американское общество катарактальной и рефракционной хирургии, Американское общество увеита и Ассоциация исследований зрения и офтальмологии

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Ричард Х. Синерт, DO Профессор неотложной медицины, клинический ассистент профессора медицины, директор по исследованиям, Медицинский колледж Государственного университета Нью-Йорка; Консультирующий персонал, отделение неотложной медицины, Больничный центр округа Кингс

Richard H Sinert, DO является членом следующих медицинских обществ: Американский колледж врачей и Общество академической неотложной медицины

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Франсиско Талавера, PharmD, PhD Адъюнкт-профессор, Фармацевтический колледж Медицинского центра Университета Небраски; Главный редактор Medscape Drug Reference

Раскрытие информации: Заработная плата Medscape

Кит Цанг, MD Врач-резидент, клинический помощник инструктора, отделение неотложной медицины, Государственный университет штата Нью-Йорк, Больница округа Кингс

Кит Цанг, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Американского колледжа врачей скорой помощи, Ассоциации резидентов скорой помощи и Общества академической неотложной медицины

.

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Шьям Верма, MBBS, DVD, FAAD Доцент кафедры дерматологии Университета Вирджинии; Адъюнкт-профессор кафедры дерматологии Государственного университета Нью-Йорка в Стонибруке, адъюнкт-профессор кафедры дерматологии Пенсильванского университета

Шьям Верма, MBBS, DVD, FAAD является членом следующих медицинских обществ: Американская академия дерматологии

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Ричард П. Винсон, доктор медицины Ассистент клинического профессора, кафедра дерматологии, Центр медицинских наук Техасского технологического университета, Медицинская школа Пола Л. Фостера; Консультант, дерматология Маунтин-Вью, Пенсильвания

Ричард П. Винсон, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Американской академии дерматологии, Ассоциации военных дерматологов, Техасского дерматологического общества и Техасской медицинской ассоциации

.

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Эрик Л. Вайс, доктор медицинских наук, DTM&H Медицинский директор, Управление непрерывности обслуживания и планирования бедствий, директор по стипендиям, стипендия Медицинского центра Стэнфордского университета, председатель Целевой группы SUMC и LPCH по биотерроризму и готовности к чрезвычайным ситуациям, клинический младший преподаватель, Департамент Хирургия (неотложная медицинская помощь), Медицинский центр Стэнфордского университета

Эрик Л. Вайс, доктор медицинских наук, DTM&H, является членом следующих медицинских обществ: Американский колледж врачей скорой помощи, Американский колледж медицины труда и окружающей среды, Американская медицинская ассоциация, Американское общество тропической медицины и гигиены, Врачи за социальную ответственность, Юго-восточное хирургическое общество. Конгресс, Южная ассоциация онкологии, Южное клиническое неврологическое общество и Медицинское общество дикой природы

Раскрытие информации: Нечего раскрывать.

Нетрадиционные и новые методы диагностики туберкулеза: возможности и применимость в полевых условиях

Реферат

Туберкулез (ТБ) остается одной из основных причин смерти от одного инфекционного агента во всем мире. Серьезную озабоченность в борьбе с ТБ вызывает появление лекарственной устойчивости. Поскольку от некоторых штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью не существует лекарства, существует опасение, что они могут распространиться по всему миру, что подчеркивает необходимость дополнительных мер контроля, таких как новые средства диагностики, более совершенные лекарства для лечения и более эффективные вакцина.

Легочный ТБ можно диагностировать по его симптомам, рентгенографии органов грудной клетки, микроскопии мазка мокроты и путем культивирования M. tuberculosis , что считается золотым стандартом. Недавние достижения в области молекулярной биологии и молекулярной эпидемиологии, а также лучшее понимание молекулярных основ лекарственной устойчивости при ТБ предоставили новые инструменты для быстрой диагностики; однако высокая стоимость большинства этих методов и потребность в сложном оборудовании и квалифицированном персонале препятствуют их внедрению на постоянной основе, особенно в странах с низким уровнем дохода.

Другие предложенные нетрадиционные диагностические подходы включают поиск биохимических маркеров, обнаружение иммунологического ответа и раннее обнаружение M. tuberculosis методами, отличными от подсчета колоний.

В настоящей статье будут рассмотрены некоторые из этих подходов и обсуждена возможность их реализации в диагностических лабораториях.

Туберкулез (ТБ) остается одной из основных причин смерти от одного инфекционного агента во всем мире.В общей сложности 99% из примерно двух миллионов смертей и 95% из более чем восьми миллионов новых случаев ежегодно приходится на страны со средним и низким уровнем дохода. Согласно отчету Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 1, за 2002 г. глобальная заболеваемость составила 8,8 миллиона новых случаев, включая 3,9 миллиона пациентов с положительным мазком. На 22 страны с высоким бременем приходится 80% этих случаев. Эта ситуация усугубляется пандемией ВИЧ, так как риск смерти у ВИЧ-инфицированных больных туберкулезом в два раза выше, чем у ВИЧ-инфицированных больных без туберкулеза 2.По оценкам, по состоянию на 2000 год 12 миллионов пациентов коинфицированы ВИЧ и Mycobacterium tuberculosis , причем большинство из них проживает в странах Африки к югу от Сахары и Юго-Восточной Азии.

Серьезную озабоченность в борьбе с этим заболеванием вызывает появление лекарственной устойчивости (ЛУ), поскольку не существует лекарства от некоторых штаммов M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), и есть опасения, что они могут быстро мир. ЛУ была обнаружена во всех обследованных странах и регионах, особенно в Восточной Европе, а новые районы с высокой распространенностью МЛУ-ТБ включают Китай и Иран 3.Короткий курс лечения под непосредственным наблюдением (DOTS), стратегия лечения, одобренная ВОЗ, эффективна для предотвращения возникновения ДР; однако на практике только 27% больных туберкулезом фактически получают DOTS 4, что подчеркивает необходимость дополнительных мер контроля, таких как новые диагностические инструменты, более эффективные лекарства или даже более эффективная вакцина.

Легочный ТБ, наиболее важный вид ТБ с точки зрения общественного здравоохранения, может быть диагностирован по его симптомам, рентгенографии грудной клетки, микроскопии мазка мокроты и культивированию M.туберкулез . Однако процент пациентов не подтверждается бактериологически и диагностируется только на основании сильного клинического подозрения и реакции на противотуберкулезные препараты 5.

Золотым стандартом диагностики ТБ является культивирование M.tuberculosis . Это может быть выполнено на различных образцах, таких как мокрота и бронхиальные смывы, а также на других нелегочных образцах. Он гораздо более чувствителен, чем микроскопия, и позволяет извлекать бактерии для других исследований, таких как определение чувствительности к лекарствам и генотипирование.В некоторых случаях диагностика ТБ становится еще более проблематичной из-за ряда факторов, связанных с иммуносупрессией у больных, как это происходит у ВИЧ-инфицированных лиц, в случае латентной инфекции или внелегочного ТБ. Из-за неспецифической клинической картины диагностика туберкулеза также проблематична у детей.

Последние достижения в области молекулярной биологии и прогресс в понимании молекулярных основ ЛУ М.tuberculosis предоставили новые инструменты для его экспресс-диагностики молекулярными методами 6.Однако высокая стоимость большинства этих методов и потребность в сложном оборудовании или высококвалифицированном персонале препятствуют их рутинному внедрению, особенно в странах с низким уровнем дохода 7. Другие недавно предложенные нетрадиционные подходы включают поиск биохимических маркеров. , обнаружение иммунологического ответа и раннее обнаружение M. tuberculosis методами, отличными от подсчета колоний. В настоящей статье будут рассмотрены некоторые из этих подходов и обсуждена возможность их реализации в диагностических лабораториях.

НОВЫЕ МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ

В виду того что одна треть населенности миров заражена с туберкулезом M. , было бы важно мочь предсказать среди латентно зараженных начнет заболевание, для того чтобы обработать их прежде чем активный TB будет начат. Единственным доступным тестом для выявления инфекции до недавнего времени была туберкулиновая кожная проба (ТКП). Однако недавно были предложены альтернативные методы in vitro на основе Т-клеток 8–10.Анализ интерферона (IFN)-γ основан на том факте, что Т-клетки, сенсибилизированные туберкулезными антигенами, будут продуцировать IFN-γ при повторном воздействии микобактериальных антигенов. Затем предполагается, что высокий уровень продукции IFN-γ коррелирует с туберкулезной инфекцией 11. Первые анализы IFN-γ использовали очищенное производное белка (PPD) в качестве стимулирующего антигена; более поздние анализы используют антигены, специфичные для M. tuberculosis , такие как ранний секреторный антиген-мишень 6 (ESAT6) и белок культурального фильтрата 10 (CFP10) 8.Эти белковые антигены кодируются генами, расположенными в области различия 1 (RD1) генома M. tuberculosis , и являются гораздо более специфичными, чем PPD, поскольку они не являются общими с M. bovis bacillus calette-guerin (BCG). ) или большинство нетуберкулезных микобактерий (НТМ), за исключением M. marinum , M. sulzgai и M. kansassi .

В настоящее время существует два коммерческих анализа IFN-γ, анализ QuantiFERON-TB (Cellestis Ltd., Карнеги, Австралия) и тест T SPOT-TB (Oxford Immunotec, Оксфорд, Великобритания). Эти тесты измеряют выработку IFN-γ Т-клетками в ответ на антигены ТБ с помощью ELISA и иммуноферментного анализа соответственно. QuantiFERON-TB, анализ цельной крови, первоначально использовал PPD в качестве антигена, а расширенная версия QuantiFERON-TB Gold использует ESAT6 и CFP10. Напротив, в анализе T SPOT-TB используются мононуклеарные клетки периферической крови и ESAT6 и CFP10 в качестве антигенов для измерения количества Т-клеток, продуцирующих IFN-γ.Также были предложены некоторые некоммерческие внутренние методы 12.

В целом проведенные исследования показали, что анализы IFN-γ с использованием антигенов RD1 имеют некоторые преимущества перед ТКП, такие как более высокая специфичность, лучшая корреляция с предыдущим воздействием M. tuberculosis и низкая перекрестная реакция из-за БЦЖ вакцинация или предыдущее воздействие НТМ. Кроме того, было обнаружено, что анализы IFN-γ, в которых используются коктейли антигенов, а не отдельные антигены, обладают большей точностью13.Однако необходимы дополнительные исследования, чтобы оценить полезность этих тестов для лечения лиц с ослабленным иммунитетом, детей и пациентов с внелегочным туберкулезом.

НЕТРАДИЦИОННЫЕ И НОВЫЕ МЕТОДЫ БАКИЛЛОСКОПИИ

Во многих странах диагностика туберкулеза проводится путем микроскопического исследования окрашенного мазка мокроты по методу Циля-Нильсена (ZN). Хотя он прост в выполнении и специфичен, ему не хватает чувствительности: для положительного результата требуется ≥10 000 бацилл·мл 90 647 -1 90 648 мокроты.Было проведено несколько исследований для оценки полезности добавления химического реагента, такого как гипохлорит натрия, для разжижения и последующего концентрирования мокроты путем дальнейшего центрифугирования для повышения чувствительности. В большинстве этих исследований было получено статистически значимое улучшение доли положительных мазков или чувствительности; однако по ряду причин гипохлорит натрия, также известный как метод «отбеливания», во многих случаях не используется рутинно. комбинация аурамина-О и родамина 15.Этот флуоресцентный метод связан с более высокой скоростью обнаружения, поскольку предметные стекла можно исследовать при меньшем увеличении. В недавнем исследовании по проверке квалификации, проведенном в 167 лабораториях, аураминовый метод и/или аураминовый/родаминовый метод показали лучшие результаты, чем окрашивание ZN или его модификация Киньюна 16. Поэтому обычно считается, что флуоресцентному методу следует отдавать предпочтение перед Методы ЗН и Киньюна. Как правило, флуоресцентный метод следует использовать в лабораториях с большим количеством образцов.Однако это дороже, чем обычное окрашивание ZN, требующее флуоресцентного микроскопа 17.

НЕТРАДИЦИОННЫЕ И НОВЫЕ МЕТОДЫ КУЛЬТУРЫ

Культивирование M.tuberculosis из клинических образцов является золотым стандартом диагностики активного ТБ. Он может обнаружить 100 бацилл·мл -1 мокроты по сравнению с 5 000–10 000 бацилл·мл -1 , необходимыми для микроскопии 18. Он также предоставляет материал для дальнейшей идентификации и тестирования лекарственной чувствительности.Обычные методы культивирования основаны на средах на основе яиц и агара, таких как среда Левенштейна-Йенсена (LJ) и агар Миддлбрука 19, 20. После процедур обеззараживания и разжижения образцы мокроты инокулируются и инкубируются для морфологического роста, обычно происходит после нескольких недель инкубации. Идентификация M.tuberculosis осуществляется путем проведения нескольких дополнительных биохимических тестов 19, 21. Однако это трудоемко и занимает много времени, требуя от 3 до 8 недель для получения результатов.

Внедрение радиометрической системы BACTEC (BACTEC TB-460; Becton Dickinson, Sparks, MD, USA) в 1980-х годах стало прорывом, поскольку она позволила обнаружить M. tuberculosis за несколько дней по сравнению с неделями в традиционной питательные среды 22. Однако использование радиоизотопов и стоимость оборудования препятствуют их использованию на рутинной основе, за исключением справочных лабораторий, преимущественно в развитых странах. Несколько лет назад Becton Dickinson предложил другую систему, основанную на флуоресцентном обнаружении роста микобактерий 23.Система индикаторной трубки роста микобактерий (MGIT) основана на стеклянной трубке, содержащей модифицированный бульон Миддлбрука 7H9 вместе с датчиком кислорода на основе тушения флуоресценции, встроенным в нижнюю часть трубки. При инокуляции M.tuberculosis потребление растворенного кислорода вызывает флуоресценцию при освещении УФ-лампой. Система MGIT была тщательно протестирована в клинических условиях для обнаружения и выделения микобактерий. Бадак и др. . 24 сравнили систему MGIT с культуральной средой BACTEC TB-460 и LJ на 1441 клиническом образце.Из 178 выделенных изолятов 30 (17%) были M. tuberculosis с помощью системы MGIT, из которых было выделено 28 (93%) по сравнению с 25 (83%), выделенными с помощью среды LJ. В другом многоцентровом исследовании Pfyffer et al . 25 проанализировали 1500 клинических образцов, обнаружив в общей сложности 180 видов микобактерий, включая 113 комплексных изолятов M.tuberculosis . Комбинация MGIT и BACTEC выявила 171 (95%) всех изолятов со временем до обнаружения M.tuberculosis из 9.9 дней по сравнению с 9,7 днями при использовании BACTEC и 20,2 дня при использовании твердой среды, что доказывает, что MGIT является ценной альтернативой радиометрической системе 25.

Совсем недавно система MGIT была полностью автоматизирована и преобразована в систему BACTEC MGIT 960, которая представляет собой нерадиометрическую неинвазивную систему с пробирками, инкубируемыми в компактной системе, которая автоматически считывает данные. В многоцентровом исследовании система BACTEC MGIT 960 сравнивалась с радиометрической системой BACTEC TB-460 и средой LJ.При анализе 2576 образцов наилучший выход был получен при использовании BACTEC TB-460 (201 изолят) по сравнению со 190 изолятами при использовании BACTEC MGIT 960 и 168 изолятами при использовании среды LJ 26. В другом исследовании Idigoras et al . 27 сравнивали систему BACTEC MGIT 960 по чувствительности и времени обнаружения микобактерий на плотной среде и микроскопию на твердой среде. Чувствительность каждой среды по сравнению со всеми средами, объединенными для роста M.tuberculosis , составляла 93%, 76%, 79% и 75% для MGIT 960, Middlebrook 7h21, LJ и Coletsos соответственно.Время обнаружения с помощью системы MGIT 960 составило 12,7 дней по сравнению с >20 днями с использованием твердых сред. В целом как автоматизированная, так и ручная системы MGIT показали схожие результаты, сопоставимые с результатами, полученными ранее с помощью радиометрического метода BACTEC. До сих пор отсутствуют исследования операционной эффективности и экономической эффективности, в которых оценивалось бы реальное влияние этих систем на страны с низким и средним уровнем дохода.

Другие недавние разработки для быстрого обнаружения микобактерий включают ручные методы, такие как MB-Redox (Heipha Diagnostika Biotest, Гейдельберг, Германия), основанные на восстановлении индикатора соли тетразолия в жидкой среде 28, и автоматизированные методы на основе оборудования, такие как MB /BacT (Organon Teknika, Boxtel, Holland), основанная на колориметрическом обнаружении диоксида углерода, образующегося при росте микобактерий в закрытой системе 29, и культуральной системе ESP II (Trek Diagnostics, Inc., Кливленд, Огайо, США) на основе обнаружения изменений давления в культуральной среде запечатанного флакона во время роста микобактерий 30. Эти системы не получили широкого распространения за пределами лабораторий в промышленно развитых странах.

Другой недавней и интересной разработкой является анализ на основе фагов, основанный на способности M.tuberculosis поддерживать рост заражающего микобактериофага. Количество эндогенных фагов, представляющее исходное количество жизнеспособных M.tuberculosis , затем определяется в быстрорастущих микобактериях, таких как M. smegmatis 31. Анализ FASTPlaque TB (BIOTEC, Ипсвич, Саффолк, Великобритания), коммерческий тест, основанный на этой технологии, был предложен в качестве теста что при использовании в сочетании с микроскопией мазка можно увеличить диагностику ТБ 32. Было проведено несколько исследований для оценки этой технологии. Альберт и др. . 32 в сравнительном исследовании с микроскопией аураминового мазка и средой LJ в 1692 образцах мокроты было обнаружено, что тест FASTPlaque TB выявляет ТБ в 75% случаев с подтвержденным посевом и в 70% случаев с клиническим диагнозом ТБ со специфичностью 98.7% и 99,0% соответственно. Напротив, микроскопия мазка с концентрированным аурамином имела чувствительность 63,4% и 61,3% и специфичность 97,4% и 97,3% в культурально-подтвержденных и всех случаях соответственно 32.

Другое исследование, проведенное в Пакистане, сравнило FASTPlaque TB с микроскопией кислотоустойчивых мазков и культурой в среде LJ 33. Для FASTPlaque TB они обнаружили чувствительность и специфичность 87,4 и 88,2% соответственно в образцах с положительным мазком и чувствительность и специфичность 67.1 и 98,4% соответственно в образцах с отрицательным мазком. Как обсуждалось Takiff и Heifets34, наиболее важным результатом этих исследований было то, что FASTPlaque TB был способен обнаруживать микобактерии в 50–65% образцов с отрицательным мазком со специфичностью 98%, и что комбинация теста с мазком микроскопия подтвердила наличие M.tuberculosis в 80–90% культур-позитивных образцов. Тем не менее, около 13% образцов с положительным мазком не были обнаружены тестом FASTPlaque TB, а в образцах с отрицательным мазком 8–19% образцов дали ложноположительный результат.

Совсем недавно, в сравнительном исследовании теста FASTPlaque TB и оригинального внутреннего метода, проведенного в Замбии, Mbulo et al . 35 обнаружили, что ни один из методов не может превзойти прямую микроскопию в образцах мокроты. Кроме того, с помощью теста FASTPlaque TB была получена степень контаминации 40%, что свидетельствует о том, что анализы на основе фагов не дают никаких преимуществ для диагностики ТБ в этих условиях. Некоторые другие технологии на основе фагов были предложены для быстрого обнаружения M.туберкулез 36, 37; однако они не были тщательно оценены в клинических условиях в высокоэндемичных странах.

НЕТРАДИЦИОННЫЕ МЕТОДЫ И НОВЫЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ

Идентификация микобактерий традиционно основывалась на нескольких биохимических тестах и ​​фенотипических характеристиках, таких как скорость роста и пигментация, которые позволяют отнести один конкретный штамм к группе четко определенных микобактерий. Несмотря на то, что они просты в выполнении и не требуют сложного оборудования, они, тем не менее, трудоемки и громоздки в выполнении, что во многих случаях задерживает своевременную и правильную идентификацию микобактерий.Тем не менее, они остаются и составляют основную процедуру идентификации в клинических лабораториях, особенно в условиях ограниченных ресурсов. Профили миколевой кислоты микобактерий также были предложены в качестве быстрой альтернативы для идентификации. Это может быть выполнено с помощью тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии, которая имеет то преимущество, что ее можно выполнить за несколько часов, она относительно недорога и может идентифицировать широкий спектр видов микобактерий. Первоначальные вложения в стоимость оборудования составляют его главный недостаток как метода идентификации 38.

Недавно для идентификации микобактерий были внедрены молекулярные методы. Первым из таких доступных методов был AccuProbe (Gen-Probe, Inc., Сан-Диего, Калифорния, США), коммерческий метод, основанный на видоспецифичных ДНК-зондах, которые гибридизуются с рРНК для идентификации нескольких важных микобактерий, включая M.tuberculosis комплекс, M.avium , M.intracellulare , M.avium комплекс, M.kansasii и M.гордона . Зонды были всесторонне оценены в клинических условиях и показали очень хорошую чувствительность и специфичность, что дало результаты примерно через 2 часа из образцов с положительным посевом 39.

Другие коммерчески доступные методы включают INNO-Lipa Mycobacteria (LiPA; Innogenetics, Гент, Бельгия) для одновременного обнаружения и идентификации микобактерий, включая комплекс M. tuberculosis и основанный на амплификации спейсерной области 16S–23S в сочетании с анализ линия-зонд обратной гибридизации.Он был оценен в сравнении с ДНК-зондами, обычными биохимическими тестами и анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ПЦР, показавшим четкие результаты 40, 41

Совсем недавно был представлен анализ GenoType Mycobacterium (Hain Diagnostika, Nehren, Germany) для идентификации из клинических образцов и жидких культур. Он основан на амплификации спейсерной области рибосомной ДНК 16S–23S с последующей гибридизацией с 16 специфическими олигонуклеотидными зондами; его преимущество заключается в обнаружении смешанных микобактериальных инфекций 42.

Также была предложена коммерческая система, предназначенная в первую очередь для культурального подтверждения, флуоресцентной гибридизации нуклеиновой кислоты пептида ТБ in situ (Dako, A/S Glostrup, Дания). Он основан на зондах пептидных нуклеиновых кислот, которые связываются с выбранными областями последовательностей 16S рРНК микобактерий, что позволяет различать туберкулезный и НТМ; обнаружение осуществляется с помощью флуоресценции гибридизации in situ с последующим микроскопическим исследованием 43. Он также был испытан на прямое обнаружение M.tuberculosis на образцах мокроты с положительным мазком и на фиксированных формалином биоптатах, залитых парафином 44.

Методы секвенирования на основе ПЦР в настоящее время широко используются во многих лабораториях для идентификации микобактерий. Они состоят из амплификации микобактериальной ДНК с родоспецифичными праймерами с последующим секвенированием амплифицированных продуктов. Идентификацию проводят путем сравнения последовательностей с последовательностями эталонных штаммов 45, 46. Наиболее часто используемой мишенью был ген, кодирующий 16S рРНК, хотя были охарактеризованы и другие гены-мишени 47, 48.

ПЦР-анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (PRA) гена, кодирующего белок теплового шока hsp65, также использовался для быстрой идентификации микобактерий, включая M. tuberculosis 49. В нескольких недавних исследованиях PRA показал хорошие результаты по сравнению с обычные методы 50, 51.

Совсем недавно ДНК-микрочипы или массивы олигонуклеотидов высокой плотности стали применяться для видовой идентификации микобактерий. Метод основан на гибридизации флуоресцентно меченных амплифицированных продуктов ПЦР, полученных из колоний микобактерий, с матрицами ДНК, содержащими нуклеотидные зонды 52, 53.

В целом, молекулярные методы имеют ряд преимуществ по сравнению с обычными методами быстрого обнаружения и идентификации M. tuberculosis , такие как время получения результатов, надежность, воспроизводимость и возможность улучшить ведение пациентов. Однако из-за потребности в дополнительном оборудовании и обученном персонале большинство этих методов еще не получили легкого доступа к рутинным процедурам, выполняемым в клинической микобактериологической лаборатории, особенно в странах с низким уровнем дохода, где ТБ является более серьезной проблемой здравоохранения.

НЕТРАДИЦИОННЫЕ И НОВЫЕ МЕТОДЫ ТЕСТИРОВАНИЯ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ЛЕКАРСТВЕННЫМ СРЕДСТВАМ

Методы определения лекарственной чувствительности (ТЛЧ) включают метод пропорции, метод абсолютной концентрации и метод отношения резистентности 19, 54. С внедрением радиометрической системы BACTEC и ее адаптацией для проведения ТЛЧ M. tuberculosis 22, 55 эти четыре метода считались золотым стандартом. 56. Длительное время обработки (TAT) и трудоемкость этих методов стимулировали поиск альтернативных и более быстрых методов.Эти новые методы можно разделить на генотипические и фенотипические.

Генотипические методы

Эти методы ищут генетические детерминанты резистентности, а не фенотип резистентности. Как правило, они состоят из двух основных этапов: этап молекулярной амплификации нуклеиновых кислот, такой как ПЦР для амплификации участков генома M.tuberculosis , о которых известно, что они изменены в устойчивых штаммах, и второй этап оценки амплифицированных продуктов на наличие специфических мутаций. коррелирует с сопротивлением.Эти методы имеют несколько преимуществ: более быстрое ТАТ (дни вместо недель), отсутствие необходимости выращивания организма, возможность прямого применения к клиническим образцам, снижение рисков биологической опасности и возможность автоматизации. К сожалению, у них есть и недостатки, в том числе проблемы с ингибиторами при применении этих методов непосредственно к клиническим образцам.

Секвенирование ДНК

продуктов, амплифицированных с помощью ПЦР, было наиболее широко используемым методом, ставшим золотым стандартом.Это выполнялось как вручную, так и автоматическими процедурами, хотя последние использовались чаще всего 57–59. Он был тщательно использован для характеристики мутаций в гене rpoB в штаммах, устойчивых к рифампицину, и для выявления мутаций, ответственных за устойчивость к другим противотуберкулезным препаратам 57, 60, 61. Для выявления устойчивости к антибиотикам было предложено несколько других генотипических методов, таких как как ПЦР-конформационный полиморфизм одной цепи 57, ПЦР-образование гетеродуплекса 62 и анализы твердофазной гибридизации.Кроме того, Line Probe Assay (LiPA-Rif), основанный на гибридизации амплифицированной ДНК культивируемых штаммов или клинических образцов с десятью зондами, охватывающими центральную область гена rpoB M. tuberculosis , иммобилизованных на нитроцеллюлозной полоске 63, и тест GenoType mycobacterium tuberculosis (MTB) DR (Hain, Германия) — коммерческая система для выявления комплекса М.tuberculosis и его устойчивости к рифампицину и изониазиду из образцов культур, основанная на выявлении наиболее частых мутаций в гены rpoB и katG соответственно.Анализ LiPA-Rif был оценен в различных условиях и дал обнадеживающие результаты 64.

ДНК-микрочипы

и методы ПЦР в реальном времени также были предложены в качестве альтернативных методов обнаружения лекарственной устойчивости; первое все еще находится за пределами досягаемости клинико-диагностических лабораторий, а второе оценивается все чаще с многообещающими результатами 65, 66.

Фенотипические методы

Новые фенотипические методы оценивают ингибирование М.tuberculosis в присутствии антибиотиков путем обнаружения более ранних признаков роста с использованием различных технологий, например, измерения метаболизма с помощью цветовых индикаторов или потребления кислорода, ранней визуализации микроколоний и применения фагов.

Система MGIT в ее ручной или автоматизированной версии, основанная на измерении потребления кислорода, прошла тщательную оценку ТЛЧ M. tuberculosis к препаратам первого и второго ряда, показав хорошее соответствие методу пропорции золотого стандарта. 67–69.

Еще одна коммерческая система E-test (AB BIODISK, Solna, Швеция), основанная на полосках с пропитанными градиентами антибиотиков для определения чувствительности к лекарственным средствам, позволяет считывать минимальные ингибирующие концентрации непосредственно на чашках с агаром. В нескольких исследованиях этот тест оценивался по сравнению с пропорциональным методом, обнаружив соответствие >90 % 70. Двумя другими коммерческими и автоматизированными методами ТЛЧ являются система MB/BacT (Organon Technika) и культуральная система II ESP (Accumed International, Чикаго). , Иллинойс, США).Обе системы полагаются на тяжелое оборудование и также были оценены в нескольких исследованиях 71, 72.

Среди недавно примененных внутренних методов ТЛЧ M.tuberculosis упоминания заслуживают три типа методов: 1) анализы на основе фагов; 2) колориметрические методы; и 3) анализ восстановления нитратов.

Применение фаговых анализов для ТЛЧ, либо в качестве исходного внутреннего метода 73, либо в качестве коммерческого анализа 74, применяется для выявления устойчивости к рифампицину M.tuberculosis как в культуральных образцах, так и непосредственно из мокроты. Результаты доступны в среднем через 2 дня с соответствием> 95% по сравнению с методом пропорции золотого стандарта.

Колориметрические методы основаны на уменьшении количества цветного индикатора, добавленного в культуральную среду после того, как M. tuberculosis подверглись воздействию in vitro различных антибиотиков. Резистентность выявляют по изменению окраски индикатора, которая прямо пропорциональна количеству жизнеспособных микобактерий в среде 75.Различные показатели были оценены для ТЛЧ к препаратам первого и второго ряда, что дало сопоставимые результаты и согласуется с методом пропорции золотого стандарта 76–78.

Анализ восстановления нитратов представляет собой очень простой метод, основанный на способности M.tuberculosis восстанавливать нитраты до нитритов, что обнаруживается путем добавления химического реагента в культуральную среду. M.tuberculosis культивируют в присутствии антибиотика, и его способность восстанавливать нитраты измеряют через 10 дней инкубации.Резистентные штаммы будут снижать содержание нитратов, проявляющееся в розово-красной окраске среды, в то время как восприимчивые штаммы теряют эту способность, поскольку они ингибируются антибиотиком, оставляя среду бесцветной 79. препараты второго ряда с хорошими результатами 80, 81. Дополнительным преимуществом этого метода является использование того же формата и питательной среды, что и в методе стандартной пропорции.

В своем нынешнем формате колориметрические методы кажутся более подходящими для референс-лабораторий с оборудованием и условиями биобезопасности для работы с небольшими объемами жидких культур в формате микропланшетов.Анализ на основе фагов можно применять в микобактериологических диагностических лабораториях с соответствующим обученным персоналом, в то время как анализ на восстановление нитратов идеально подходит для использования в диагностических лабораториях ТБ, регулярно выполняющих ТЛЧ.

В таблице 1⇓ показаны основные методы ТЛЧ с точки зрения точности, стоимости, простоты использования и оцениваемых препаратов.

Таблица. 1—

Характеристики нескольких методов определения лекарственной чувствительности

МЕТОДЫ АМПЛИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Значительным улучшением в диагностике ТБ стала разработка нескольких методов амплификации нуклеиновых кислот (АНК), таких как ПЦР, которые прошли всестороннюю оценку для экспресс-диагностики ТБ.В последние годы было разработано и протестировано несколько внутренних методов ПЦР, и было опубликовано несколько исследований по применению ПЦР для диагностики туберкулеза 82, 83. Эти исследования показали, что отсутствие специфичности было большей проблемой, чем отсутствие чувствительность, и это не было связано с использованием какого-либо конкретного метода. Также было обнаружено, что многие лаборатории не использовали надлежащий контроль качества 84, 85.

В настоящее время существует два одобренных коммерческих метода NAA: амплифицированный M.прямой тест на туберкулез (AMTD) (Gen-Probe) и тест Amplicor M. tuberculosis (Amplicor; Roche Diagnostic Systems, Inc., Нью-Джерси, США). MTD основан на методе, описанном Kwoh et al. . 86 с использованием амплификации рибосомных транскриптов 16S, которые выявляются с помощью ДНК-зонда 87. Amplicor представляет собой ДНК-тест, который амплифицирует ген 16S рРНК с использованием родоспецифичных праймеров и обнаруживает в колориметрической реакции 88. Оба метода были одобрены для прямое обнаружение М.tuberculosis в образцах из дыхательных путей с положительным мазком. Совсем недавно расширенный MTD также был одобрен для отрицательных по мазку образцов из дыхательных путей пациентов с подозрением на мазок 89. В нескольких исследованиях оценивали оба теста для обнаружения M. tuberculosis в клинических образцах 90. По сравнению с посевом и клиническим статусом, эти методы имеют высокую чувствительность и специфичность в образцах с положительным мазком, но более низкие значения получаются в образцах с отрицательным мазком, что исключает их использование в качестве скрининга для исключения заболевания.По этой причине рекомендуется всегда интерпретировать молекулярные методы в сочетании с клиническими данными пациента 91.

Две другие методики, недавно представленные для диагностики ТБ, включают ПЦР в реальном времени и методы амплификации методом смещения цепи. Технология ПЦР в реальном времени основана на гибридизации амплифицированных нуклеиновых кислот с флуоресцентно-мечеными зондами, охватывающими интересующие области ДНК и контролируемыми внутри термоциклеров 92. Флуоресцентный сигнал увеличивается прямо пропорционально количеству амплифицированного продукта в реакционной пробирке.

ПЦР в реальном времени оценивалась в нескольких исследованиях культурального материала, а совсем недавно — в клинических образцах. Чувствительность в этих исследованиях колеблется в пределах 71–98%, а специфичность близка к 100% 93. Основным преимуществом ПЦР в реальном времени является скорость получения результатов, 1,5–2  часа после выделения ДНК, а также снижение риска загрязнения, так как и реакция, и обнаружение происходят в одной пробирке. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить реальную ценность этой новой методологии в клинических условиях.

Метод амплификации со смещением нити используется в тесте BDProbe Tec MTB, полуавтоматической системе, разработанной Becton Dickinson для быстрого обнаружения M. tuberculosis в образцах из дыхательных путей. Он основан на ферментативной репликации последовательностей-мишеней вставочной последовательности IS6110 и гена 16S рРНК. Амплифицированные продукты обнаруживаются с помощью люминометра 94. Тест BDProbe Tec MTB оценивался в нескольких исследованиях; Пфайффер и др. .95 в исследовании 799 респираторных образцов получили общую чувствительность 97,6% и специфичность 95%. Однако основными недостатками были наличие ложноположительных результатов, которые были уменьшены после того, как персонал приобрел опыт работы с этим методом, а время, необходимое для подготовки образца, составляло ≥2 часов. Усовершенствованная версия этой системы, BDProbe Tec ET (Becton Dickinson), недавно была оценена на образцах из дыхательных путей в клинических условиях 96. Для подтверждения этих предварительных результатов необходимы исследования, включающие большее количество пациентов с положительным результатом на ТБ.В таблице  2⇓ приведены значения чувствительности и специфичности основных тестов NAA.

Таблица. 2—

Чувствительность и специфичность методов амплификации нуклеиновых кислот в различных образцах #

МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ЭПИДЕМИОЛОГИИ

Методы фингерпринтинга ДНК

включают типирование полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) как наиболее часто используемый метод в изучении эпидемиологии и патогенеза ТБ. Он основан на вставочной последовательности IS6110, присутствующей в M.tuberculosis и принят в качестве стандартного метода типирования 97. ПДРФ использовался для дифференциации штаммов M. tuberculosis , для мониторинга передачи, для определения кластеров штаммов в популяциях, для дифференциации экзогенного повторного заражения и рецидива, для выявления лабораторных перекрестное загрязнение, для изучения молекулярной эволюции на уровне видов и для лучшего понимания патогенеза заболевания.

Другим широко используемым методом молекулярного типирования является спейсерное олиготипирование или сполиготипирование, которое представляет собой простой метод, позволяющий одновременно обнаруживать и типировать M.tuberculosis в клинических образцах. Он основан на полиморфизме хромосомного локуса DR, который содержит переменное количество коротких прямых повторов, перемежающихся неповторяющимися спейсерами. Большинство клинических изолятов демонстрируют уникальные паттерны гибридизации, в то время как штаммы из кластера имеют один и тот же паттерн 98. Для этой цели также использовалось типирование полиморфных GC-богатых повторяющихся последовательностей (PGRS) 99. PGRS является наиболее распространенным повторяющимся элементом в M .tuberculosis , который присутствует во многих копиях и состоит из тандемных повторов GC-богатой последовательности из 96 пар оснований (bp).Типирование PGRS в основном используется в качестве вторичного метода типирования штаммов с низким числом копий IS6110.

Совсем недавно были разработаны два других метода молекулярного типирования на основе ПЦР: анализ геномных делеций и типирование микобактериальных вкрапленных повторяющихся единиц (MIRU) 100, 101. Анализ геномных делеций использует ДНК-микрочипы для обнаружения геномных делеций относительно эталонного штамма . М. туберкулез . Его можно использовать для получения информации об эпидемиологии, геномной эволюции и структуре популяции M.туберкулез .

Типирование MIRU основано на изменчивости количества тандемных повторов, которые представляют собой элементы размером 40–100  п.н., рассеянные в межгенных областях генома M. tuberculosis ; всего у M.tuberculosis идентифицирован 41 локус, 12 из них проявляют полиморфизм. Этот метод типирования сравнивали с типированием RFLP и сполиготипированием, создавая более четкие шаблоны 102. В настоящее время считается, что методы на основе MIRU в конечном итоге заменят классическое типирование IS6110 RFLP после того, как будет разработан стандартизированный протокол 103.

СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА

Важным вопросом борьбы с ТБ является возможность диагностики и лечения латентной инфекции. Традиционным методом оценки этого является TST. PPD, используемый в TST, использовался в течение 50 лет для диагностики ТБ в клинике и для скрининга в программах борьбы с ТБ в эпидемиологических целях 8. PPD представляет собой грубую смесь антигенов с тем ограничением, что некоторые из них являются общими для M. туберкулез , М.bovis BCG и некоторые NTM. Из-за этого ТКП имеет низкую специфичность в популяциях, вакцинированных БЦЖ, и у тех, кто ранее подвергался воздействию НТМ 11. Чувствительность также может быть низкой у лиц с ослабленным иммунитетом, таких как ВИЧ-инфицированные.

Для серологической диагностики ТБ были предложены различные виды анализов крови 5, 104, 105. Первые исследования с использованием частично очищенных антигенов позволили выявить антимикобактериальные антитела у больных ТБ, но тесты показали низкую специфичность 106.Использование высокоочищенных нативных или рекомбинантных антигенов повышало специфичность, но снижало чувствительность. Также было обнаружено, что степень гуморального ответа на ТБ неоднородна 107; по этой причине было предложено использовать серодиагностические тесты на основе смесей множественных антигенов M. tuberculosis 108. Однако до сих пор ни один из этих тестов не показал достаточной прогностической способности, чтобы оправдать их рутинное использование в качестве диагностических тестов на ТБ. .

ДРУГИЕ НЕМИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Среди немикробиологических диагностических методов, применяемых при туберкулезе, обнаружение аденозиндезаминазы (АДА) получило наибольшее внимание как непрямой метод диагностики.АДА представляет собой фермент, присутствующий в большинстве клеток, но было обнаружено, что его уровень увеличивается при туберкулезном плевральном выпоте (ТПЭ). Диагностика ТПЭ затруднена из-за низкой чувствительности прямой микроскопии и посева. Кроме того, лимфоцитарные экссудаты могут возникать при других заболеваниях, таких как злокачественные новообразования и системная красная волчанка 109. Определение уровня АДА считается многообещающим маркером, поскольку его можно легко, быстро и недорого выполнить с помощью колориметрического метода. Ли и др. .110 показали, что уровни АДА, обнаруженные в других группах пациентов, не превышали диагностический пороговый уровень для ТПО. В других исследованиях оценивалась полезность измерения уровня АДА в спинномозговой жидкости для диагностики туберкулезного менингита и в сыворотке крови для диагностики туберкулеза легких. Эти исследования показали, что измерение уровня АДА не является хорошим маркером для постановки диагноза 111, 112.

Совсем недавно комбинированное использование ПЦР и АДА для диагностики ТПЭ в регионе с высокой распространенностью ТБ позволило подтвердить заболевание у 14 из 16 положительных пациентов.Согласно рекомендациям, АДА следует использовать не для замены существующих методов диагностики, а в качестве дополнительного инструмента диагностики 113.

ВНЕДРЕНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ НОВЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ

Было предложено несколько новых диагностических подходов к ТБ, и в ближайшем будущем наверняка появится еще несколько. Наиболее важное соображение, которое необходимо учитывать при выборе новых методов диагностики, заключается в том, что они должны быть такими же или лучше, чем существующие в настоящее время инструменты, и в то же время быть подходящими для стран с низким уровнем ресурсов, где бремя ТБ является более значительным.Например, методы NAA, особенно коммерческие наборы, преимущество которых состоит в том, что они хорошо стандартизированы и воспроизводимы, показали высокую чувствительность и специфичность в образцах с положительным мазком; однако эти значения намного ниже в образцах с отрицательным мазком или во внелегочных образцах, где полезность этих новых инструментов была бы гораздо более желательной. Еще одним важным соображением является стоимость, поскольку при нынешних ценах эти коммерческие наборы все еще недоступны для большинства диагностических лабораторий ТБ в странах с низким уровнем ресурсов.Другие молекулярные процедуры даже требуют использования сложного дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала, которые доступны только в развитых странах или в центральных лабораториях в странах, эндемичных по ТБ. До тех пор, пока эти ограничения не будут должным образом устранены, дорогие коммерческие наборы, использующие методы NAA, будут по-прежнему доступны только развитым странам или академическим и исследовательским лабораториям с соответствующим финансированием, но далеко от программ борьбы с ТБ.

Что касается серологических подходов к диагностике ТБ, то ни один из предложенных до сих пор тестов с использованием различных микобактериальных антигенов не показал достаточной прогностической способности, чтобы оправдать их рутинное использование в качестве диагностического теста на ТБ.По-видимому, тесты с использованием коктейля антигенов, а не одного более специфичного антигена, дали лучшие результаты. Многообещающими являются новые тесты на основе ELISA, такие как тест QuantiFERON-TB и анализ T SPOT-TB, которые измеряют выработку IFN-γ активированными Т-клетками; однако необходимы дополнительные исследования в различных условиях, чтобы оценить их полезность в качестве диагностического инструмента в определенных группах населения, например, у лиц с ослабленным иммунитетом в результате ВИЧ-инфекции или других заболеваний, а также у детей. Стоимость этих тестов, поскольку они также доступны в виде коммерческого комплекта, повлияет на возможность их проведения на регулярной основе в будущем.

Тесты на основе фагов также оценивались в различных условиях либо в виде коммерческого набора, либо в качестве внутреннего метода. Низкая чувствительность, полученная в некоторых из этих исследований, могла быть связана с низкой инфекционностью фагов, на которую также могут влиять возраст и состояние образцов 35. Напротив, в исследованиях, в которых фаговые методы показали повышенная чувствительность по сравнению с прямой микроскопией и культурой, объем используемого образца был до пяти раз больше, чем для культуры.Похоже, что в своем нынешнем формате фаговые тесты не готовы в качестве инструмента для улучшения диагностики ТБ. Тем не менее, они подходят для быстрого выявления устойчивости к рифампицину 73.

Многие исследования в поисках более новых и быстрых методов диагностики ТБ проводятся в надежде найти «волшебную пулю», позволяющую диагностировать ТБ в течение нескольких часов или на месте. Возможно, так быть не должно, и исследователи не должны исключать простые и прагматичные подходы, более близкие к тому, что можно реализовать в диагностических лабораториях ТБ в странах с высокой эндемичностью.Например, простая методика, описанная Mejia и др. . 114 и основанный на быстром обнаружении микроколоний M.tuberculosis под стандартным микроскопом, позволил обнаружить >60% положительных образцов в течение первых 10 дней, а через 2 недели >80% были положительными при микроконтроле. -метод колоний по сравнению с 10% на среде LJ. Те же авторы в отчете, включающем более 1800 клинических образцов, показали чувствительность 72% по сравнению со стандартным культивированием в среде LJ и пришли к выводу, что одновременное использование обеих сред повышает чувствительность обнаружения 115.Другие недавние подходы, такие как описанный Angeby et al . 79, использование восстановления нитратов следует изучить в качестве инструмента экспресс-диагностики. Питательные среды, включающие нитрат калия и рифампицин, могут быть использованы непосредственно на деконтаминированных образцах мокроты для одновременного обнаружения не только M. tuberculosis , но и устойчивых к рифампицину бацилл. Тот же подход можно использовать с недавно описанными колориметрическими методами, включающими цветные индикаторы в среду и инокуляцией непосредственно обеззараженными образцами мокроты.

И последнее соображение заключается в том, что любой новый метод или подход, сложный или нет, коммерческий или внутренний, должен оцениваться в хорошо спланированных и контролируемых клинических испытаниях и тестироваться в высокоэндемичных условиях с низким уровнем ресурсов, где внедрение и использование эти методы более необходимы для улучшения борьбы с туберкулезом.

Сноски

  • Предыдущие статьи из этой серии: № 1: Кардона П.-Дж., Руис-Мансано Дж.О природе Mycobacterium tuberculosis – латентные бациллы. Eur Respir J 2004; 24: 1044–1051. № 2: Rieder H. Ежегодный риск заражения Mycobacterium tuberculosis . Eur Respir J 2005; 25: 181–185. № 3: Митчисон Д.А. Лекарственная устойчивость при туберкулезе. Eur Respir J 2005; 25: 376–379. № 4: Ким С.Дж. Тестирование лекарственной чувствительности при туберкулезе: методы и достоверность результатов. Eur Respir J 2005; 25: 564–569. № 5: Длодло Р.А., Фудзивара П.И., Энарсон Д.А. Следует ли по-разному подходить к лечению и борьбе с туберкулезом у ВИЧ-инфицированных и неинфицированных? Eur Respir J 2005; 25: 751–757. № 6: Каминеро Дж.А. Ведение пациентов с множественной лекарственной устойчивостью туберкулеза и пациентов, находящихся на повторном лечении. Eur Respir J 2005; 25: 928–936. № 7: Дасгупта К., Мензис Д. Экономическая эффективность стратегий борьбы с туберкулезом среди иммигрантов и беженцев. Eur Respir J 2005; 25: 1107–1116. № 8: Мартин К. Мечта о вакцине против туберкулеза; новые вакцины улучшают или заменяют БЦЖ? Eur Respir J 2005; 26: 162–167.

  • Принята 26 апреля 2005 г.
  • Принята 28 апреля 2005 г.

Список литературы

  1. Всемирная организация здравоохранения. Глобальная борьба с туберкулезом: эпиднадзор, планирование, финансирование. Отчет ВОЗ. Женева, WHO/HTM/TB/2004.331, 2004

  2. Барнс П.Ф., Лейки Д.Л., Берман В.Дж.Туберкулез у больных ВИЧ-инфекцией. Infect Dis Clin North Am 2002; 16: 107–126.

  3. Всемирная организация здравоохранения. Устойчивость к противотуберкулезным препаратам в мире. Отчет № 2. Распространенность и тенденции. ВОЗ/CDS/ТБ/2000.278, 2000

  4. Onyebujoh P, Rook GAW. Туберкулез. Nat Rev Microbiol 2004;2:930–932.

  5. Чан Э.Д., Хейфец Л., Исеман М.Д.Иммунологическая диагностика туберкулеза: обзор. Tuber Lung Dis 2000; 80: 131–140.

  6. Takiff H. Молекулярные механизмы лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis . В : Бастиан I, Портаэлс Ф, ред. Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью. Дордрехт, Нидерланды, Kluwer Academic Publishers, 2000; стр. 77–114

  7. Foulds J, O’Brien R. Новые инструменты для диагностики туберкулеза: перспективы развивающихся стран.Int J Tuberc Lung Dis 1998; 2: 778–783.

  8. Андерсен П., Мунк М.Е., Поллок Дж.М., Доэрти Т.М. Специфическая иммунологическая диагностика туберкулеза. Ланцет 2000;356:1099–1104.

  9. Докрелл Х.М., Вейр Р.Э. Анализы цельной крови на цитокины – новое поколение диагностических тестов на туберкулез? Int J Tuberc Lung Dis 1998; 6: 441–442.

  10. Лалвани А.Выявление латентной инфекции: путь к лучшей борьбе с туберкулезом. Торакс 2003; 58: 916–918.

  11. Pai M, Riley LW, Colford JM Jr. Интерферон-гамма анализы в иммунодиагностике туберкулеза: систематический обзор. Lancet Infect Dis 2004;4:761–776.

  12. Лейн А.Д., Фон Рейн С.Ф. In vitro клеточные и цитокиновые ответы на микобактериальные антигены: применение для диагностики туберкулезной инфекции и оценки ответа на микобактериальные вакцины.Am J Med Sci 1997;313:364–371.

  13. Брок И., Мунк М.Е., Кок-Йенсен А., Андерсен П. Выполнение теста IFN-гамма цельной крови для диагностики туберкулеза на основе PPD или специфических антигенов ESAT-6 и CFP-10. Int J Tuberc Lung Dis 2001; 5:462–467.

  14. Ангеби К.А., Хоффнер С.Е., Диван В.К. Следует ли рекомендовать «метод отбеливающей микроскопии» для улучшения выявления случаев туберкулеза? Обзор литературы и анализ ключевых лиц.Int J Tuberc Lung Dis 2004; 8: 806–815.

  15. Ба Ф, Ридер ХЛ. Сравнение флуоресцентной микроскопии с методом Циля-Нильсена при исследовании мокроты на кислотоустойчивые бациллы. Int J Tuberc Lung Dis 1999; 3:1101–1105.

  16. Somoskövi Á, Hotaling JE, Fitzgerald M. Уроки мероприятия по проверке квалификации для кислотоустойчивой микроскопии. Грудь 2001; 120: 250–257.

  17. Ласло А.Туберкулез: 7. Лабораторные аспекты диагностики. CMAJ 1999; 160: 1725–1729.

  18. Тирувилуамала П., Райхман Л.Б. Туберкулез. Annu Rev Public Health 2002; 23:403–426.

  19. Кент ТК, Кубица ГП. Микобактериология общественного здравоохранения. Руководство для лаборатории уровня III. Атланта, Центр контроля заболеваний, 1985 г.

  20. Хейфец Л. Лаборатория микобактериологии.Clin Chest Med 1997; 18:35–53.

  21. Metchock BG, Nolte FS, Wallace RJ Jr. Mycobacterium. В : Murray PR, изд. Руководство по клинической микробиологии, 7-е изд. Вашингтон, округ Колумбия, Американское общество микробиологии, 1999 г.; стр. 399–437

  22. Робертс Г.Д., Гудман Н.Л., Хейфец Л., и др. Оценка радиометрического метода BACTEC для выделения микобактерий и определения лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis из кислотоустойчивых образцов с положительным мазком.J Clin Microbiol 1983;18:689–696.

  23. Ханна Б.А., Уолтерс С.Б., Бонк С.Дж., Тик Л.Дж. Извлечение микобактерий из крови в пробирке индикатора роста микобактерий и наклонной плоскости Левенштейна-Йенсена после лизирующего центрифугирования. J Clin Microbiol 1995;33:3315–3316.

  24. Бадак Ф.З., Киска Д.Л., Сеттерквист С., Хартли С., О’Коннелл М.А., Хопфер Р.Л. Сравнение пробирки-индикатора роста микобактерий с BACTEC 460 для обнаружения и выделения микобактерий из клинических образцов.J Clin Microbiol 1996; 34:2236–2239.

  25. Pfyffer GE, Welscher HM, Kissling P, et al. Сравнение пробирок-индикаторов роста микобактерий (MGIT) с радиометрическими и твердыми культурами для выделения кислотоустойчивых бацилл. J Clin Microbiol 1997; 35:364–368.

  26. Tortoli E, Cichero P, Piersimoni C, Simonetti MT, Gesu G, Nista D. Использование BACTEC MGIT 960 для выделения микобактерий из клинических образцов: многоцентровое исследование.J Clin Microbiol 1999;37:3578–3582.

  27. Idigoras P, Beristain X, Iturzaeta A, Vicente D, Perez-Trallero E. Сравнение автоматизированной нерадиометрической системы Bactec MGIT 960 и твердых сред Löwenstein-Jensen, Coletsos и Middlebrook 7h21 для выделения микобактерий. Eur J Clin Microb Infect Dis 2000;19:350–354.

  28. Cambau E, Wichlacz C, Truffot-Pernot C, Jarlier V. Оценка новой окислительно-восстановительной системы MB для обнаружения роста микобактерий.J Clin Microbiol 1999; 37:2013–2015.

  29. Rohner P, Ninet B, Metral C, Emler S, Auckenthaler R. Оценка системы MB/BacT и сравнение с системой BACTEC 460 и твердыми средами для выделения микобактерий из клинических образцов. J Clin Microbiol 1997;35:3127–3131.

  30. Вудс Г.Л., Фиш Г., Плаунт М., Мерфи Т. Клиническая оценка системы культивирования difco ESP II для роста и обнаружения микобактерий.J Clin Microbiol 1997; 35:121–124.

  31. McNerney R. Технология репликации фагов для диагностики и тестирования чувствительности. В : Пэриш Т., Стокер Н.Г., ред. Mycobacterium tuberculosis протоколы. Methods in Molecular Medicine. Totowa, NY, Humana Press, 2001; стр. 145–154

  32. Альберт Х., Хейденрих А., Брукс Р., и др. Проведение экспресс-теста на основе фагов FASTPlaqueTB для диагностики туберкулеза легких по образцам мокроты в Южной Африке.Int J Tuberc Lung Dis 2002; 6: 529–537.

  33. Музаффар Р., Батул С., Азиз Ф., Накви А., Ризви А. Оценка анализа FASTPlaqueTB для прямого обнаружения Mycobacterium tuberculosis в образцах мокроты. Int J Tuberc Lung Dis 2002; 6: 635–640.

  34. Такифф Х., Хейфец Л. В поисках средств быстрой диагностики и выявления лекарственной устойчивости: ответит ли тест FASTPlaqueTB? Int J Tuberc Lung Dis 2002; 6: 560–561.

  35. Mbulo GM, Kambashi BS, Kinkese J, et al. Сравнение двух тестов с бактериофагами и амплификации нуклеиновых кислот для диагностики туберкулеза легких в странах Африки к югу от Сахары. Int J Tuberc Lung Dis 2004; 8: 1342–1347.

  36. Carriere C, Riska PF, Zimhony O, et al. Условно реплицирующиеся репортерные фаги люциферазы: повышенная чувствительность для быстрого обнаружения и оценки лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis .J Clin Microbiol 1997; 35:3232–3239.

  37. Banaiee N, Bobadilla-Del-Valle M, Bardarov S Jr, et al. Репортерные микобактериофаги люциферазы для обнаружения, идентификации и тестирования чувствительности к антибиотикам Mycobacterium tuberculosis в Мексике. J Clin Microbiol 2001;39:3883–3888.

  38. Батлер В.Р., Гутерц Л.С. Анализ миколевой кислоты с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии для идентификации видов микобактерий.Clin Microbiol Rev 2001; 14:704–726.

  39. Эванс К.Д., Накасоне А.С., Сазерленд П.А., де ла Маза Л.М., Петерсон Э.М. Идентификация Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium avium-M. intracellulare непосредственно из первичных культур BACTEC с использованием ДНК-зондов, меченных сложным эфиром акридиния. J Clin Microbiol 1992;30:2427–2431.

  40. Миллер Н., Инфанте С., Клири Т.Оценка анализа LiPA MYCOBACTERIA для идентификации видов микобактерий из бутылочек BACTEC 12B. J Clin Microbiol 2000; 38:1915–1919.

  41. Suffys PN, da Silva Rocha A, de Oliveira M, et al. Быстрая идентификация микобактерий до видового уровня с помощью метода обратной гибридизации INNO-LiPA Mycobacteria. Дж. Клин. Микробиол 2001;39:4477–4482.

  42. Руис П., Гутьеррес Дж., Зероло Ф.Дж., Касаль М.Анализ микобактерий GenoType для идентификации видов микобактерий, выделенных из клинических образцов человека, с использованием жидкой среды. J Clin Microbiol 2002;40:3076–3078.

  43. Стендер Х., Лунд К., Петерсен К.Х., и др. Флуоресцентный гибридизационный анализ in situ с использованием зондов пептидных нуклеиновых кислот для дифференциации туберкулезных и нетуберкулезных видов микобактерий в мазках культур микобактерий. J Clin Microbiol 1999;37:2760–2765.

  44. Зерби П., Шонау А., Бонетто С., и др. Амплифицированная гибридизация in situ с пептидными зондами нуклеиновых кислот для дифференциации комплекса Mycobacterium tuberculosis и нетуберкулезных видов Mycobacterium на фиксированных в формалине и залитых парафином образцах архивной биопсии и аутопсии. Ам Дж. Клин Патол 2001; 116: 770–775.

  45. Рогалл Т., Флор Т., Боттгер Э.С.Дифференциация видов Mycobacterium путем прямого секвенирования амплифицированной ДНК. J Gen Microbiol 1990;136:1915–1920.

  46. Киршнер П., Спрингер Б., Фогель Ю., и др. Генотипическая идентификация микобактерий путем определения последовательности нуклеиновых кислот: отчет о двухлетнем опыте работы в клинической лаборатории. J Clin Microbiol 1993; 31:2882–2889.

  47. Soini H, Bottger EC, Viljanen MK.Идентификация микобактерий путем определения последовательности 32-килодальтонного гена белка методом ПЦР. J Clin Microbiol 1994;32:2944–2947.

  48. Рот А., Фишер М., Хамид М.Е., Михальке С., Людвиг В., Маух Х. Дифференциация филогенетически родственных медленно растущих микобактерий на основе внутренних транскрибируемых спейсерных последовательностей гена рРНК 16S–23S. J Clin Microbiol 1998;36:139–147.

  49. Теленти А., Маркези Ф., Бальц М., Балли Ф., Боттгер Э.К., Бодмер Т.Быстрая идентификация микобактерий до видового уровня с помощью полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа. J Clin Microbiol 1993;31:175–178.

  50. да Силва Роча А., да Коста Лейте С., Торрес Х.М., и др. Использование ПЦР-анализа полиморфизма длины фрагмента рестрикции гена hsp65 для быстрой идентификации микобактерий в Бразилии. J Microbiol Methods 1999;37:223–229.

  51. Эргин А, Кочагоз Т, Ус Д.Оценка 120 штаммов микобактерий, выделенных из клинических образцов, на видовой уровень с помощью полимеразно-цепной реакции-рестрикционного анализа. Scand J Infect Dis 2000; 32: 657–662.

  52. Gingeras TR, Ghandour G, Wang E, и др. Одновременное генотипирование и идентификация видов с использованием анализа распознавания образов гибридизации на матрицах ДНК родовых микобактерий. Genome Res 1998; 8: 435–448.

  53. Troesch A, Nguyen H, Miyada CG, et al. Идентификация видов микобактерий и определение устойчивости к рифампицину с использованием массивов ДНК-зондов высокой плотности. J Clin Microbiol 1999; 37:49–55.

  54. Канетти Г., Фокс В., Хоменко А., и др. Достижения в методах тестирования чувствительности микобактерий к лекарствам и использование тестов на чувствительность в программах борьбы с туберкулезом. Bull World Health Organ 1969; 41:21–43.

  55. Сиддики С.Х., Либонати Дж.П., Миддлбрук Г.Оценка экспресс-радиометрического метода определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза. J Clin Microbiol 1981;13:908–912.

  56. Heifets LB, Cangelosi GA. Тестирование чувствительности микобактерий туберкулеза к лекарствам: забытая проблема на рубеже веков. Int J Tuberc Lung Dis 1999; 3: 564–581.

  57. Cooksey RC, Morlock GP, McQueen A, Glickman SE, Crawford JT.Характеристика механизмов устойчивости к стрептомицину среди изолятов Mycobacterium tuberculosis от пациентов в Нью-Йорке. Противомикробные агенты Chemother 1996;40:1186–1188.

  58. Дельгадо М.Б., Теленти А. Обнаружение мутаций, связанных с устойчивостью к хинолонам, у Mycobacterium tuberculosis . В : Persing DH, изд. Избранные протоколы ПЦР для возникающих инфекционных заболеваний. Вашингтон, округ Колумбия, Американское общество микробиологии, 1996 г.; стр.138–143

  59. Теленти А., Имбоден П., Маркези Ф., и др. Обнаружение мутаций устойчивости к рифампицину у Mycobacterium tuberculosis . Ланцет 1993; 341: 647–650.

  60. Takiff HE, Salazar L, Guerrero C, и др. Клонирование и нуклеотидная последовательность генов Mycobacterium tuberculosis gyrA и gyrB и обнаружение мутаций устойчивости к хинолонам.Противомикробные агенты Chemother 1994;38:773–780.

  61. Местдаг М., Фонтейн П.А., Реалини Л., и др. Взаимосвязь между устойчивостью к пиразинамиду, потерей активности пиразинамидазы и мутациями в локусе pncA в полирезистентных клинических изолятах Mycobacterium tuberculosis . Противомикробные агенты Chemother 1999;43:2317–2319.

  62. Williams DL, Waguespack C, Eisenach K, et al. Характеристика устойчивости к рифампину патогенных микобактерий. Противомикробные агенты Chemother 1994; 38:2380–2386.

  63. Де Бенхауэр Х., Лхианг З., Яннес Г., и др. Быстрое определение устойчивости к рифампицину в мокроте и биоптатах больных туберкулезом с помощью ПЦР и линейного зондового анализа. Tuberc Lung Dis 1995;76:425–430.

  64. Россау Р., Траоре Х., Де Бенхауэр Х., и др. Оценка INNO-LiPA Rif. Анализ ТБ, анализ обратной гибридизации для одновременного обнаружения комплекса Mycobacterium tuberculosis и его устойчивости к рифампину. Противомикробные агенты Chemother 1997;41:2093–2098.

  65. Sougakoff W, Rodriguez M, Truffot-Pernot C, et al. Использование массива ДНК-зондов высокой плотности для обнаружения мутаций, связанных с устойчивостью к рифампицину в Mycobacterium tuberculosis .Clin Microbiol Infect 2004; 10: 289–294.

  66. Ruiz M, Torres MJ, Llanos AC, Arroyo A, Palomares JC, Aznar J. Прямое обнаружение устойчивых к рифампину и изониазиду Mycobacterium tuberculosis в образцах мокроты, положительных по аурамин-родамину, с помощью ПЦР в реальном времени. J Clin Microbiol 2004;42:1585–1589.

  67. Палачи М., Уеки С.Ю., Сато Д.Н., и др. Оценка пробирки-индикатора роста микобактерий для выделения и определения лекарственной чувствительности изолятов Mycobacterium tuberculosis из респираторных образцов.J Clin Microbiol 1996;34:762–764.

  68. Palomino JC, Traore H, Fissette K, Portaels F. Оценка пробирки индикатора роста микобактерий (MGIT) для определения лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis . Int J Tuberc Lung Dis 1999; 3:344–348.

  69. Сандерс К.А., Ниеда Р.Р., Десмонд Э.П. Валидация использования агара Миддлбрук 7х20, сред BACTEC MGIT 960 и BACTEC 460 12B для тестирования чувствительности Mycobacterium tuberculosis к левофлоксацину.J Clin Microbiol 2004;42:5225–5228.

  70. Хаусдорфер Дж., Сомпек Э., Аллербергер Ф., Дирих М.П., ​​Руш-Гердес С. Е-тест для определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis . Int J Tuberc Lung Dis 1998; 2: 751–755.

  71. Tortoli E, Mattei R, Savarino A, Bartolini L, Beer J. Сравнение тестов на чувствительность Mycobacterium tuberculosis , выполненных с помощью систем BACTEC 460TB (Becton Dickinson) и MB/BacT (Organon Teknika).Diagn Microbiol Infect Dis 2000;38:83–86.

  72. Руис П., Зероло Ф.Дж., Касаль М.Дж. Сравнение тестирования чувствительности Mycobacterium tuberculosis с использованием системы культивирования ESP II с тестированием по методу BACTEC. J Clin Microbiol 2000;38:4663–4664.

  73. Симболи Н., Такифф Х., МакНерни Р., и др. Внутренний анализ амплификации фагов является надежной альтернативой для выявления устойчивых к рифампину Mycobacterium tuberculosis в условиях ограниченных ресурсов.Противомикробные агенты Chemother 2005;49:425–427.

  74. Альберт Х., Троллип А., Моряк Т., Крот Р.Дж. Простая технология на основе фагов (FASTPplaque) для определения устойчивости к рифампицину Mycobacterium tuberculosis непосредственно из мокроты. Int J Tuberc Lung Dis 2004; 8: 1114–1119.

  75. Palomino JC, Martin A, Camacho M, Guerra H, Swings J, Portaels F. Планшет для микротитрования резазурина: простой и недорогой метод определения лекарственной устойчивости у Mycobacterium tuberculosis .Противомикробные агенты Chemother 2002;46:2720–2722.

  76. Яйко Д.М., Мадей Дж.Дж., Ланкастер М.В., и др. Колориметрический метод определения МИК противомикробных препаратов для Mycobacterium tuberculosis . J Clin Microbiol 1995;33:2324–2327.

  77. Abate G, Mshana RN, Miorner H. Оценка колориметрического анализа на основе бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (MTT) для быстрого выявления устойчивости к рифампицину у Микобактерии туберкулеза .Int J Tuberc Lung Dis 1998; 2:1011–1016.

  78. Мартин А., Камачо М., Портаэлс Ф., Паломино Дж.С. Тестирование планшетов для анализа резазурином на микротитрационном планшете Mycobacterium tuberculosis на чувствительность к препаратам второго ряда: быстрый, простой и недорогой метод. Противомикробные агенты Chemother 2003;47:3616–3619.

  79. Ангеби К.А., Клинц Л., Хоффнер С.Е. Быстрое и недорогое тестирование лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis с помощью анализа нитратредуктазы.J Clin Microbiol 2002;40:553–555.

  80. Монторо Э., Лемус Д., Эхемендиа М., Мартин А., Портаэлс Ф., Паломино Дж. К. Сравнительная оценка анализа восстановления нитратов, теста МТТ и анализа микротитров резазурина для тестирования лекарственной чувствительности клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis . J Antimicrob Chemother 2005; 55: 500–505.

  81. Мартин А., Паломино Дж. К., Портаэлс Ф.Быстрое выявление устойчивости к офлоксацину у Mycobacterium tuberculosis с помощью двух недорогих колориметрических методов: анализа резазурина и нитратредуктазы. J Clin Microbiol 2005;43:1612–1616.

  82. Сандин Р.Л. Полимеразная цепная реакция и другие методы амплификации в микобактериологии. Clin Lab Med 1996; 16: 617–633.

  83. Кернс А.М., Фриман Р., Стюард М., Маги Дж.Г. Метод быстрой полимеразной цепной реакции для обнаружения M.tuberculosis в различных клинических образцах. Дж. Клин Патол, 1998; 51:922–924.

  84. Noordhoek GT, ван Эмбден JD, Колк, AH. Надежность амплификации нуклеиновых кислот для обнаружения Mycobacterium tuberculosis : международное совместное исследование по контролю качества с участием 30 лабораторий. J Clin Microbiol 1996;34:2522–2525.

  85. Suffys P, Palomino JC, Cardoso Leão S, и др. Оценка полимеразной цепной реакции для обнаружения Mycobacterium tuberculosis . Int J Tuberc Lung Dis 2000;4:179–183.

  86. Kwoh DY, Davis GR, Whitfield KM, Chappelle HL, DiMichele LJ, Gingeras TR. Система амплификации на основе транскрипции и обнаружение амплифицированного вируса иммунодефицита человека типа 1 с использованием формата сэндвич-гибридизации на основе шариков. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 1173–1177.

  87. Абэ С., Хирано К., Вада М., и др. Обнаружение Mycobacterium tuberculosis в клинических образцах с помощью полимеразной цепной реакции и прямого теста Gen-Probe с амплифицированными микобактериями туберкулеза. J Clin Microbiol 1993;31:3270–3274.

  88. Dalovisio JR, Черногория-Джеймс С., Кеммерли С.А. Сравнение прямого теста Amplified Mycobacterium tuberculosis (MTB), Amplicor MTB PCR и IS6110-PCR для обнаружения MTB в образцах из дыхательных путей. Clin Infect Dis 1996; 23:1099–1106.

  89. ЦКЗ. Амплификация нуклеиновых кислот при туберкулезе. MMWR 2000; 49: 593–594.

  90. Rajalahti I, Vuorinen P, Liippo K, Nieminen MM, Miettinen A. Оценка коммерческих анализов амплификации ДНК и рРНК для оценки результатов лечения больных туберкулезом легких. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2001;20:746–750.

  91. Pfyffer GE.Лабораторная диагностика туберкулеза. В : Kaufmann SHE, Hahn H, ред. Микобактерии и туберкулез. Базель, Каргер, Швейцария, 2003 г.; стр. 67–83

  92. Шампута И.С., Ригутс Л., Портаэлс Ф. Молекулярно-генетические методы диагностики и определения устойчивости микобактерий к антибиотикам из клинических образцов. АПМИС 2004; 112:728–752.

  93. Брокколо Ф., Скарпеллини П., Локателли Г., и др. Быстрая диагностика микобактериальных инфекций и количественный анализ Mycobacterium tuberculosis с помощью двух калиброванных ПЦР в реальном времени. J Clin Microbiol 2003;41:4565–4572.

  94. Бергманн Дж.С., Вудс Г.Л. Клиническая оценка анализа амплификации со смещением нити BDProbeTec для экспресс-диагностики туберкулеза. J Clin Microbiol 1998;36:2766–2768.

  95. Pfyffer GE, Funke-Kissling P, Rundler E, Weber R.Эксплуатационные характеристики системы BDProbeTec для прямого обнаружения комплекса Mycobacterium tuberculosis в образцах из дыхательных путей. J Clin Microbiol 1999;37:137–140.

  96. Бергманн Дж.С., Китинг В.Е., Вудс Г.Л. Клиническая оценка системы BDProbeTec ET для быстрого обнаружения Mycobacterium tuberculosis . J Clin Microbiol 2000;38:863–865.

  97. van Embden JD, Cave MD, Crawford JT, и др. Идентификация штамма Mycobacterium tuberculosis с помощью фингерпринтинга ДНК: рекомендации по стандартизированной методологии. J Clin Microbiol 1993;31:406–409.

  98. Камербек Дж., Шоулс Л., Колк А., и др. Одновременное выявление и дифференциация штамма Mycobacterium tuberculosis для диагностики и эпидемиологии. J Clin Microbiol 1997;35:907–914.

  99. ван Солинген Д., де Хаас П.П., Херманс П.В., Гроенен П.М., ван Эмбден Д.Д.Сравнение различных повторяющихся элементов ДНК в качестве генетических маркеров дифференциации штаммов и эпидемиологии Mycobacterium tuberculosis . J Clin Microbiol 1993;31:1987–1995.

  100. Goguet de la Salmoniere YO, Kim CC, Tsolaki AG, Pym AS, Siegrist MS, Small PM. Высокопроизводительный метод обнаружения полиморфизмов геномных делеций. J Clin Microbiol 2004;42:2913–2918.

  101. Снабж П., Лесжан С., Савин Э., Кремер К., ван Солинген Д., Лохт К.Автоматизированное высокопроизводительное генотипирование для изучения глобальной эпидемиологии Mycobacterium tuberculosis на основе микобактериальных вкраплений повторяющихся единиц. J Clin Microbiol 2001;39:3563–3571.

  102. Коуэн Л.С., Мошер Л., Дием Л., Мэсси Дж.П., Кроуфорд Дж.Т. Типирование тандемных повторов с переменным числом изолятов Mycobacterium tuberculosis с низким числом копий IS6110 с использованием микобактериальных вкраплений повторяющихся единиц. J Clin Microbiol 2002;40:1592–1602.

  103. Кандума Э., Макхью Т.Д., Гиллеспи С.Х. Молекулярные методы типирования штамма Mycobacterium tuberculosis : руководство пользователя. J Appl Microbiol 2003;94:781–791.

  104. Маэкура Р., Окуда Ю., Накагава М., и др. Клиническая оценка анализа антител к противотуберкулезным гликолипидным иммуноглобулинам G для экспресс-диагностики туберкулеза легких. J Clin Microbiol 2001;39:3603–3608.

  105. Gounder C, De Queiroz Mello FC, Conde MB, и др. Полевая оценка экспресс-теста иммунохроматографии на туберкулез. J Clin Microbiol 2002;40:1989–1993.

  106. Grange JM, Laszlo A. Серодиагностические тесты на туберкулез: необходимость оценки их оперативной прогностической точности и приемлемости. Bull World Health Organ 1990; 68: 571–576.

  107. Лященко К.П., Сингх М., Коланджели Р., Дженнаро М.Л.Мультиантигенный иммуноанализ для разработки серологической диагностики инфекционных заболеваний. J Immunol Methods 2000;28:91–100.

  108. Дженнаро МЛ. Иммунологическая диагностика туберкулеза. Clin Infect Dis 2000;30: Доп. 3 С243–С246.

  109. Катария Ю.П., Хуршид И. Аденозиндезаминаза в диагностике туберкулезного плеврального выпота. Грудь 2001; 120: 334–336.

  110. Ли Ю.С., Роджерс Дж.Т., Родригес Р.М., Миллер К.Д., Лайт Р.В.Уровни аденозиндезаминазы в нетуберкулезных лимфоцитарных плевральных выпотах. Грудь 2001; 120: 356–361.

  111. Corral I, Quereda C, Navas E, и др. Активность аденозиндезаминазы в спинномозговой жидкости ВИЧ-инфицированных пациентов: ограниченное значение для диагностики туберкулезного менингита. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2004;23:471–476.

  112. Conde MB, Marinho SR, Pereira Mde F, и др. Полезность активности аденозиндезаминазы 2 (ADA2) в сыворотке у взрослых для диагностики туберкулеза легких. Respir Med 2002; 96: 607–610.

  113. Лима Д.М., Колареш Дж.К., да Фонсека Б.А. Совместное использование полимеразной цепной реакции и определение активности аденозиндезаминазы в плевральной жидкости повышает скорость диагностики туберкулеза плевры. Грудь 2003; 124: 909–914.

  114. Мехия Г.И., Кастрильон Л., Трухильо Х., Робледо Х.А.Выявление микроколоний в тонкослойной культуре 7х21 является альтернативой экспресс-диагностике инфекции Mycobacterium tuberculosis . Int J Tuberc Lung Dis 1999; 3:138–142.

  115. Мехия Г.И., Гусман А., Агудело К.А., Трухильо Х., Робледо Дж. Пятилетний опыт работы с тонкослойной агаровой средой для экспресс-диагностики туберкулеза. Biomedica 2004;24: Доп. 1 52–59.

Разработка и применение метода быстрого обнаружения микобактерий туберкулеза с помощью полимеразной спиральной реакции

Амплификация нуклеиновых кислот

права собственности.В этом методе требовалось только два праймера, каждый с одинаковой прямой последовательностью на 5′-конце, или один с прямой последовательностью, а другой с обратной последовательностью на 5′-конце, что позволяло праймерам использовать себя в качестве матриц для по существу реплицировать целевой сегмент нуклеиновой кислоты. С помощью ДНК-полимеразы Bst (большой фрагмент) целевая последовательность нуклеиновой кислоты может быть реплицирована в большом количестве при постоянной температуре в диапазоне 60–65 °C в течение 30–40 мин, что очень удобно для экспресс-теста. в постельных или полевых условиях.Для всей реакции PSR требуется только один фермент, что значительно упрощает процедуру и снижает затраты.

Механизм, лежащий в основе реакции развития окраски

Результат обнаружения наблюдали с использованием реакции проявления окраски, связанной с изменением pH, как описано ниже. Когда ДНК-полимераза добавляет свободную молекулу дезоксирибонуклеотида к зарождающейся цепи ДНК, в качестве побочного продукта образуется ион водорода, а это означает, что рН реакционной системы постоянно снижается по мере того, как образуется больше ионов водорода по мере развития реакции PSR.Раствор реакционной смеси в отсутствие трех термонестабильных компонентов – фермента, праймеров и dNTP – был термостабильным и был назван в данном исследовании ионным раствором, и его можно было приготовить путем смешивания нескольких компонентов – 20  мМ (NH 4 ) 2 SO 4 , 100 мМ KCl, 16 мМ MgSO 4 , 0,2 % Tween 20 и 1,6   M бетаина — и доведение pH примерно до 8,0 с помощью 1 % KOH. Для упрощения экспериментальной процедуры мы заранее использовали твердый герметик для герметизации 30 мкл аликвоты ионной жидкости в реакционной пробирке.В процессе обнаружения на крышку пробирки добавляли две капли (примерно 20 мкл, содержащих образец) лизирующего раствора (pH ~ 11). Витрифицированная смесь фермента, праймеров и dNTP была кислой. Смесь ионной жидкости, лизирующего раствора и застеклованной смеси образует систему с рН приблизительно 8,8. После помещения в трубку ионная жидкость изолировалась от воздуха герметиком поверх жидкости. На крышке пробирки была витрифицированная смесь четырех компонентов – фермента, праймеров, dNTP и крезолового красного-фенолового красного, при этом смесь имела темно-желтую окраску.После завершения реакции развития окраски появление желтого цвета указывало бы на положительный результат, а появление красного цвета указывало бы на отрицательный результат.

Витрификация термонестабильных компонентов

Принципы витрификации 12 кратко представлены ниже. Когда некоторые вещества испытывают температуру, равную или ниже их температуры стеклования (Tg), они образуют стекло, в котором почти отсутствуют молекулярные движения или диффузия, и поэтому вещество может сохраняться длительное время при температуре окружающей среды.В процессе стеклования вещества не кристаллизуются, а образуют чрезвычайно липкую «переохлажденную» жидкость, которая по-прежнему демонстрирует молекулярную беспорядочность — характеристику жидкостей — и поэтому стекло иногда называют «аморфным твердым телом», чтобы его можно было отличить. из настоящего твердого тела. Когда термонестабильные компоненты находятся в застеклованном состоянии, их молекулы находятся в «неактивном» состоянии, и, следовательно, молекулярная активность может сохраняться при температуре окружающей среды. Витрификация нашла множество практических применений, например, для сохранения семян.Зрелые семена воздушной сушки, посаженные после 2–5 лет хранения под запечатыванием, все еще могут прорасти. Процесс сохранения семян представляет собой естественный процесс витрификации.

В крышку пробирки добавляли следующие компоненты: 10 ЕД Bst ДНК-полимераза без глицерина, два праймера по 50 мкМ (каждый по 0,8 мкл) для Ft и Bt соответственно, два праймера по 50 мкМ (каждый по 0,4 мкл) для ИФ и IB, соответственно, жидкость для витрификации (1,0 мкл), индикатор крезоловый красный-феноловый красный (1,0 мкл) и 3,5 мкл dNTP (каждый, 10 мМ), а затем полученную систему помещали на плиту на 2–3 ч, чтобы гарантировать что витрификация завершена.Мишень, которую мы использовали для M . Обнаружение tuberculosis представляет собой вставку последовательности IS6110 (Genbank No.: CP002992.1). Праймеры PSR для амплификации последовательностей-мишеней показаны в таблице 2.

Таблица 2 Праймеры полимеразной спиральной реакции для обнаружения M . туберкулез .

Универсальный набор для обнаружения

M . туберкулез

Мы использовали метод витрификации для витрификации термонестабильных компонентов (ферментов, dNTP и праймеров для M . tuberculosis ) на крышку реакционной пробирки, поместив термостабильные компоненты (ионную жидкость) на дно реакционной пробирки и герметизировав их парафиновым воском (температура плавления 50 °C), тем самым одна пробирка, предварительно заполненная всей реакционной системой, как показано на рис. 3. Такая упаковка имела три преимущества: 1) тест-агенты на основе нуклеиновых кислот можно было хранить при комнатной температуре более 12 месяцев; 2) операция тестирования была упрощена, нужно было только добавить образцы нуклеиновых кислот в крышку пробирки; 3) герметизация парафином предотвращала загрязнение продуктов амплификации.

Рисунок 3

Схематическое изображение комплекта «все в одном». 1. Ферменты и другие термонестабильные компоненты. 2. Изоляция веществ для предотвращения загрязнения. 3. Термостабильная реакционная система.

Операционная процедура комплекта «все в одном» может быть выполнена в четыре простых шага: откройте крышку пробирки, добавьте образец в крышку, закройте крышку, переверните пробирку и переместите жидкость пробы в дно трубки, как показано на рис. 4.

Рисунок 4

Этапы работы комплекта “все в одном”.1. Откройте крышку трубки. 2. Добавьте образец на крышку. 3. Закройте крышку и переверните трубку. 4. Опустите образец жидкости на дно.

Набор для ПЦР GeneProof Mycobacterium tuberculosis

Индикация медицинское устройство для диагностики in vitro
Предполагаемый пользователь Для профессионального использования в лабораториях с обученным персоналом
Технология ПЦР в реальном времени
Тип анализа качественный
Целевая последовательность специфическая многокопийная последовательность вставки IS6110
Аналитическая специфичность

Mycobacterium tuberculosis комплекс ( M.tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, M. caprae, M. canetti и вакцинный штамм БЦЖ), 100%

Аналитическая чувствительность (LoD)

достигает до 0,191 имп/мкл с вероятностью 95 % (на Amplirun ® Контроль ДНК Mycobacterium tuberculosis, Vircell)

Управление экстракцией/ингибированием

Контроль ингибирования ПЦР (версия ISIN)

Ингибирование ПЦР и контроль эффективности экстракции ДНК (версия ISEX)

Утвержденный образец

БАЛ, ЦСЖ, мокрота, кал, мазок, моча

Хранение

-20 ± 5 °С

Валидированные методы экстракции

Система выделения нуклеиновых кислот croBEE NA16
Набор для выделения ДНК GeneProof PathogenFree

Инструменты

Система ПЦР в реальном времени croBEE*
Система ПЦР в реальном времени Applied Biosystems 7300 / 7500
Система ПЦР в реальном времени AriaMx
Система обнаружения ПЦР в реальном времени CFX Connect™ / CFX96™ / Dx
LightCycler® 2.0 / 480
LineGene 9600 / 9600 Plus
Mic qPCR Cycler
QuantStudio™ 3 / 5 ПЦР-система в реальном времени
Rotor-Gene 3000 / 6000 / Q
SLAN® ПЦР-система в реальном времени
StepOne™ / StepOnePlus™ в реальном времени Система ПЦР

Требуемые каналы обнаружения FAM, ШЕСТИГР.
Внешний контроль качества регулярно тестируется QCMD и Instand e. V. Группы внешней оценки качества – результаты на www.genproof.com
Сертификация CE IVD

Комплекс ID Gene™ Mycobacterium tuberculosis Duplex

Набор ID Gene™ Mycobacterium tuberculosis complex Duplex (IDTUB) представляет собой набор для количественной ПЦР, который амплифицирует целевую последовательность в геноме членов комплекса

Mycobacterium tuberculosis (MTC).

Этот набор представляет собой качественный тест Duplex. Он одновременно амплифицирует ДНК-мишень члена(ов) MTC ( M.tuberculosis, M. bovis, M.africanum, M. microti, M.canetti, M.caprae, и M.pinnipedii ) и экзогенный внутренний контроль.

Этот набор можно использовать для исследования лимфатических узлов и периферических тканей крупного рогатого скота, овец, коз, оленей, свиней и барсуков.

 

  • Самый чувствительный набор для ПЦР на рынке (LDPCR = 1 копия/ПЦР и метод LD = 300 мкг/мл)
  • Разработано в соответствии с требованиями Кодекса здоровья наземных животных (МЭБ) и Французской национальной справочной лаборатории по туберкулезу (ANSES)
  • Включает готовых к использованию реагентов, положительные контроли для оценки эффективности стадий экстракции и амплификации и экзогенный внутренний контроль
  • Самый быстрый протокол на рынке
  • Подходит для использования с большинством экстракционных систем и всеми термоциклерами
Технические характеристики
Код продукта ИДТУБ-50 ИДТУБ-100
Реакции 50 100
Метод КПЦР – Дуплекс – Качественный
Вид Крупный рогатый скот, овцы, козы, олени, свиные и барсуки
Типы образцов Лимфатические узлы и периферические ткани
TUB Положительный контроль экстракции
Код продукта PEC-ТУБ
Формат 550 мкл (лиофилизированный)
Описание

Сублимированный препарат инактивированного вакцинного штамма Mycobacterium bovis BCG-Copenhagen (ATCC-27290), разведенного в отрицательном супернатанте лимфатических узлов.
Подготовить и экстрагировать таким же образом, как и образцы, для проверки эффективности процессов выделения нуклеиновых кислот и амплификации qPCR, а также для мониторинга изменений аналитической чувствительности.

ID Gene ® Универсальный набор для экстракции Spin
Код продукта СПИН50 / СПИН250
Формат 50 приготовлений / 250 приготовлений
Описание

Система экстракции с использованием колонок с силикагелем для всех матриц и всех ветеринарных патогенов

Набор ID Gene™ Mag Fast Extraction
Код продукта MAGFAST384
Формат 384 приготовления
Описание

Набор для быстрой экстракции нуклеиновых кислот с помощью магнитных шариков для использования с любым матриксом или патогеном (ДНК или РНК).

Самый быстрый набор для извлечения магнитных шариков на рынке, с результатами всего за 20 минут!

⇒ Используйте в сочетании с наборами для амплификации ID Gene™, чтобы получить результаты всего за 70 минут для ДНК и 90 минут для РНК (экстракция и амплификация)

⇒ Совместимость с большинством открытых роботов для извлечения магнитных шариков

ID Gene ® Mag Universal Extraction Kit
Код продукта МАГ384
Формат 384 приготовления
Описание

Система извлечения нуклеиновых кислот на магнитных шариках для использования с любым матриксом или патогеном (ДНК или РНК).

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.

© МУНИЦИПАЛЬНОЕ АВТОНОМНОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ СРЕДНЯЯ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ШКОЛА №3