Адрианол капли для носа: Аптека Ригла – забронировать лекарства в аптеке и забрать самовывозом по низкой цене в Москва г.

Адрианол капли назальные для детей 10 мл

Адрианол для детей инструкция по применению препарата

Состав:

  • фенилэфрина хлорид-500 мкг
  • трамазолина хлорид-500 мкг

Форма выпуска:

Капли назальные 10 мл – флакон-капельницы пластиковые – пачки картонные

Фармакологическое действие:

Сосудосуживающее средство для применения в ЛОР-практике

Показание к применению:

Капли назальные для детей. Сосудосуживающий препарат для местного применения в ЛОР-практике. Фенилэфрин и трамазолин оказывают сосудосуживающее действие, что приводит к уменьшению отечности слизистой оболочки полости носа. Препарат нормализует дыхание, снижает давление в придаточных пазухах носа и среднем ухе.

Вязкая консистенция раствора увеличивает продолжительность действия препарата и предохраняет слизистую оболочку носа от высушивания.

Способ применения и дозы:

Интраназально. 

  • Препарат в форме капель назальных для взрослых закапывают взрослым и детям старше 5 лет по 1-3 капли в каждую ноздрю 4 раза/сут.
  • Препарат в форме капель назальных для детей закапывают детям в возрасте от 1 до 5 лет по 2 капли в каждую ноздрю 3 раза/сут; детям в возрасте до 1 года – по 1 капле в каждую ноздрю за 30 мин до начала кормления

Длительность применения препарата – не более 1 недели, затем необходим перерыв на несколько дней.

Противопоказания:

  • тиреотоксикоз;
  • феохромоцитома;
  • глаукома;
  • тяжелые поражения почек;
  • артериальная гипертензия;
  • ИБС;
  • распространенный атеросклероз.

Особые указания:

При длительном (свыше 20 дней) применении препарата возможно уменьшение продолжительности и выраженности его противоотечного действия.

Условия хранения:

Препарат следует хранить в сухом, защищенном от света месте при температуре не выше 25°С. 

 

показания и противопоказания, состав и дозировка – АптекаМос

Лекарственные формы

капли для детей 10мл
капли 10мл

Международное непатентованное название

?

Тримазолин+Фенилэфрин

Состав Адрианол капли для детей 10мл

Действующие вещества: фенилэфрина гидрохлорид 0,5 мг, леримазолина гидрохлорид 0,5 мг. Вспомогательные вещества: метилцеллюлоза М.Н.В. 10000 1,32 мг, бензалкония хлорид 0,20 мг, глицерол 0,015 мг, лимонной кислоты моногидрат 5,72 мг, натрия гидрофосфата дигидрат 8,11 мг, вода очищенная до 1,00 мл.

Группа

?

Средства, стимулирующие альфа-адренорецепторы

Производители

Здравле(Сербия)

Показания к применению Адрианол капли для детей 10мл

Острый и хронический ринит, синусит. Применяется в качестве вспомогательного противоотечного средства во время диагностических процедур и хирургических манипуляций.

Способ применения и дозировка Адрианол капли для детей 10мл

Дети с 3 лет: по 2 капли в каждый носовой ход 3 раза в день. Длительность применения препарата не более одной недели, затем необходим перерыв на несколько дней.

Противопоказания Адрианол капли для детей 10мл

Повышенная индивидуальная чувствительность, тиреотоксикоз, феохромоцитома, глаукома, тяжелые поражения почек, артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца, атрофический ринит, общий атеросклероз, детский возраст до 3 лет.

Фармакологическое действие

Фенилэфрин и леримазолин являются сосудосуживающими средствами, оказывающими противоотечное действие на слизистую оболочку носа при местном применении. Уменьшение отека слизистой приводит к нормализации носового дыхания и снижению давления в придаточных пазухах носа и среднем ухе. Вязкая консистенция раствора увеличивает продолжительность действия препарата.

Побочное действие Адрианол капли для детей 10мл

Жжение, болезненность или сухость слизистой оболочки носа, отек слизистой оболочки полости носа, обильные выделения, тошнота, головокружение, головная боль, нарушение вкусовой чувствительности, тахикардия, повышение артериального давления (АД), аллергические реакции. При длительном применении – ринит, заложенность носа, атрофия слизистой оболочки носа.

Передозировка

Симптомы: утомляемость, головокружение, тошнота, бессонница, повышение АД, тахикардия, лихорадка, шок, рефлекторная брадикардия.

Взаимодействие Адрианол капли для детей 10мл

В комбинации с антидепрессантами и ингибиторами моноаминооксидазы (МАО) повышается риск артериальной гипертензии.

Особые указания

Не следует применять одновременно с ингибиторами МАО и в течение 10 дней после окончания их применения. При длительном применении выраженность сосудосуживающего действия постепенно снижается (явление тахифилаксии), поэтому не следует применять в течение длительного времени, например при хроническом рините.

Условия хранения

Хранить в недоступном для детей месте, при температуре не выше 25°С.

инструкция по применению, аналоги, состав, показания

При применении этого лекарственного средства имейте в виду следующее:

Препарат следует с осторожностью применять больным с сахарным диабетом и при гипертрофии предстательной железы, поскольку действие препарата может привести к нарушению регуляции гликемии и способствовать возникновению анурии (прекращение поступления мочи в мочевой пузырь).
Перед применением лекарственного препарата, требуется проведение оценки «польза/риск» у пациентов, страдающих порфирией.
Системные нежелательные эффекты чаще встречаются у больных с заболеваниями сердечно-сосудистой системы, детей и пожилых людей.
Особую осторожность необходимо проявлять при одновременном применении с ингибиторами МАО, симпатолитиками, трициклическими антидепрессантами и другими потенциально вазопрессорными препаратами, так как они усиливают системные сердечно- сосудистые эффекты фенилэфрина и леримазолина. Следует с осторожностью применять у пациентов, принимающих антигипертензивные препараты, особенно влияющие на симпатическую нервную систему из-за риска взаимодействия и развития эффектов со стороны сердечно-сосудистой системы.
С осторожностью, по назначению врача, после оценки соотношения «польза/риск» препарат применяют у пациентов с тяжелыми заболеваниями сердечно-сосудистой системы (например, ишемическая болезнь сердца, артериальная гипертензия).
Длительное применение может привести к развитию медикаментозного ринита. Пациенты, у которых развился медикаментозный ринит, должны постепенно сокращать применение фенилэфрина/лерималозина. Пациенты должны быть проинформированы, что заложенность носа может длиться от 2 до 4 недель после прекращения лечения. Для облегчения заложенности носа спать следует на спине, чтобы открытые носовые ходы были обращены вверх. Добавление стероидов может быть полезным при более тяжелых случаях.
После интраназального введения, фенилэфрин может вызывать временное жжение, покалывание, чихание, повышенное выделение секрета слизистой оболочки носа, и/или высушивание слизистой оболочки. Часто наблюдается рикошетная заложенность слизистой оболочки носа, которая может привести к чрезмерному использованию препарата.
Поскольку применение препарата может привести к развитию хронического отека слизистой оболочки носа и риниту, следует избегать длительного лечения фенилэфрином/лерималозином. Слизистая оболочка может стать отечной и изменить цвет на красный или светло-серый, который напоминает цвет при сезонном аллергическом рините. Эти признаки обычно исчезают в течение 1 недели или более, после прекращения применения препарата.
Длительность применения препарата не должна превышать 5 дней.
Пациентам следует прекратить применение препарата и обратиться к врачу, если симптомы (например, заложенности носа) сохраняются в течение 3 дней после начала лечения.
Препарат в качестве вспомогательного вещества содержит бензалкония хлорид, который может вызвать раздражение слизистой оболочки носа.

Пожалуйста, проинформируйте Вашего лечащего врача или фармацевта, если Вы принимаете или недавно принимали другие лекарственные средства, даже если они не были Вам прописаны.
– Окситоцин усиливает гипертензивное действие фенилэфрина.
– Симпатомиметики и фенилэфрин могут вызывать тахикардию (увеличение частоты сердечных сокращений).
– Общие анестетики, которые повышают чувствительность к катехоламинам, в сочетании с фенилэфрином могут вызвать аритмию.
– Ингибиторы моноаминооксидазы (МАО), часто применяемые для лечения депрессии, увеличивают пероральную биодоступность и замедляют метаболизм фенилэфрина, а также усиливают воздействие леримазолина на сердечно-сосудистую систему.
– Резерпин и другие симпатолитики потенцируют эффект фенилэфрина и леримазолина.
– Атропина сульфат усиливает действие фенилэфрина на сердце.
–  Алкалоиды спорыньи потенцируют влияние фенилэфрина на артериальное давление.
– Препараты наперстянки также могут повысить чувствительность сердца к фенилэфрину.
– Диуретики, особенно фуросемид, могут ослаблять влияние фенилэфрина на уровень артериального давления.
– Одновременное применение с трициклическими антидепрессантами может привести к развитию аритмии.
– Одновременное применение с трициклическими антидепрессантами или другими потенциально вазопрессорными веществами может влиять на сердечно-сосудистую систему и вызвать повышение артериального давления.

Всегда принимайте Адрианол точно в соответствии с инструкциями данного листка-вкладыша. Если Вы в чем-то не уверены, спросите Вашего врача или фармацевта!
Интраназально
Взрослые и дети старше 12 лет (АДРИАНОЛ. капли назальные 1мг+1,5мг/1мл):
по 1-3 капли в предварительно очищенный носовой ход. Применяют при легком наклоне головы назад. После введения капель на короткое время следует прижать носовой ход.
Введение препарата можно повторить через 6-8 часов, но не чаще.
Длительность применения препарата не должна превышать 5 дней.
Дети от 6 до 12 лет (АДРИАНОЛ. капли назальные для детей 0,5мг+0,5мг/1мл):
по 1-2 капли в каждый носовой ход не более 3 раз в день. Применяют, в положении полусидя, при легком наклоне головы назад. После введения капель на короткое время следует прижать носовой ход.
Длительность применения препарата не должна превышать 3 дней.
Если Вы пропустили один прием препарата, примите его, как только вспомните, если это требуется, не увеличивая дозу.
Если у Вас возникли какие-либо дополнительные вопросы, связанные с применением этого препарата, пожалуйста обратитесь к Вашему врачу или фармацевту.
Если у вас сложилось впечатление, что Адрианол действует слишком слабо или слишком сильно, проконсультируйтесь с Вашим лечащим врачом или фармацевтом.

Аналогично другим α-симпатомиметикам клиническая картина интоксикации может включать, как фазы возбуждения, так и угнетения центральной нервной системы (ЦНС) и сердечнососудистой системы. Повышение артериального давления и тахикардия могут сменяться снижением артериального давления, сосудистым коллапсом, рефлекторной брадикардией. Передозировка (при пероральном приеме), особенно у детей, может приводить к нарушениям со стороны ЦНС, вызывая беспокойство, возбуждение, галлюцинации, судороги, снижение температуры тела, сонливость. Кроме того, могут возникнуть такие симптомы как: мидриаз, миоз, повышенное потоотделение, лихорадка, бледность, цианоз губ, сердечно-сосудистые нарушения, в том числе остановка сердца, нарушения со стороны дыхательной системы, в том числе дыхательная недостаточность и остановка дыхания, психические нарушения.
Лечение. В случае передозировки при интраназальном применении рекомендуется промывание носа. При случайном приеме внутрь – применение активированного угля.
При необходимости – симптоматическое лечение. В случае развития гипертензии возможно применение α-адреноблокатора.

Как и любой лекарственный препарат, Адрианол может вызвать побочные реакции, хотя они проявляются не у всех.
Местные реакции:
• Раздражение (покалывание, зуд, жжение, чихание).
• Гиперчувствительность и кросс гиперчувствительность к псевдоэфедрину.
• «Рикошетная» вазодилатация слизистой оболочки носа или развитие хронического ринита, вызванного приемом лекарственного препарата, после отмены лечения (чаще при чрезмерном использовании).
Системные реакции:
• Артериальная гипертензия, которая у детей сопровождается головной болью и рвотой.
• Отек легких.
• Аритмия.
• Галлюцинации и психические расстройства.
При приеме фенилэфрина наблюдались следующие нежелательные реакции:
Побочные реакции упорядочены в зависимости от частоты проявления с использованием классификации систем органов согласно медицинскому словарю регуляторной деятельности MedDRA:
Очень часто (≥1/10)
Часто (от ≥1/100 до <1/10)
Иногда (от ≥1/1 000 до <1/100)
Редко (от ≥1/10 000 до <1/1 000)
Очень редко (<1/10 000).
Частота не установлена (нельзя оценить по имеющимся данным).
Нарушения со стороны нервной системы
Очень редко: беспокойство, утомляемость (сонливость, седативный эффект), головная боль, галлюцинации (преимущественно у детей).
Нарушения со стороны сердечно-сосудистой системы
Редко: учащенное сердцебиение, тахикардия, артериальная гипертензия.
Очень редко: аритмии.
Нарушения со стороны органов дыхания, грудной клетки и средостения
Часто: жжение и сухость слизистой оболочки полости рта, чихание.
Иногда: после прекращения действия, повышенная отечность слизистой оболочки носа, носовые кровотечения.
Очень редко: апноэ у новорожденных и детей до года.
Нарушения со стороны скелетной мускулатуры и соединительной ткани
Очень редко: судороги (особенно у детей).
Нарушения со стороны иммунной системы
Иногда: реакции повышенной чувствительности (ангионевротический отек, сыпь, зуд).
При появлении перечисленных побочных реакций, а также реакции, не указанной в инструкции, необходимо обратиться к врачу.

капли в нос. Инструкция по применению

Перечень современных сосудосуживающих лекарственных средств огромен, если не сказать больше. Среди них и Адрианол: капли в нос.

Инструкция по применению рекомендует использовать его для лечения различных ЛОР-заболеваний. Каковы же особенности его употребления и скрытые опасности?

Как следует применять капли Адрианол

Поскольку в состав медикамента входят трамазолин и фенилэфрин, он обладает выраженными сосудосуживающими свойствами. То есть, попадая на слизистые, он вызывает сужение сосудов, проходящих в них, что приводит к:

  • устранению отека;
  • облегчению носового дыхания;
  • улучшению оттока содержимого из околоносовых синусов и снижению давления в них, а также среднем ухе.

Поэтому данные капли в нос широко применяются при:

  • острых и хронических ринитах;
  • синуситах;
  • подготовке и после проведения диагностических или лечебных отоларингологических манипуляций.
к содержанию ?

Способ применения

Капли имеют вязкую консистенцию, благодаря чему они дольше сохраняются на слизистых оболочках, что обеспечивает их пролонгированное действие. Поэтому при лечении насморка у взрослых и детей старше 7 лет препарат вводят по 1–3 капли в каждую ноздрю до 4 раз в день.

Но длительность терапии не должна превышать 7-ми дней, поскольку в противном случае капилляры слизистой оболочки привыкнут к постоянному воздействию сосудосуживающих веществ и утратят способность самостоятельно сужаться.

Следствием этого станет вазомоторный или атрофический ринит. Поэтому препарат не может применяться постоянно даже при хронических формах заболеваний.

к содержанию ?

Противопоказания и побочные реакции

Применение медикамента не показано при:

  • глаукоме;
  • феохромоцитозе;
  • тиреотоксикозе;
  • гипертонии;
  • ИБС;
  • атеросклерозе;
  • тяжелых заболеваниях почек;
  • атрофическом рините.

Безусловно, использование лекарственного средства противопоказано, если в прошлом у человека наблюдалась аллергическая реакция на любое вспомогательное или действующее вещество препарата.

Иногда после введения Адрианола пациенты отмечают возникновение в носу:

  • зуда;
  • жжения;
  • дискомфорта;
  • сухости.

Развитие этих симптомов не является поводом для немедленной отмены препарата, хотя при нарастании дискомфорта все же следует заменить его другим. В таких случаях надлежит перепроверить по инструкции правильность дозирования лекарственного средства, поскольку часто причиной появления побочных эффектов становится передозировка. В подобных ситуациях, помимо дискомфорта в носу, наблюдается:

  • повышение артериального давления;
  • слабость;
  • головокружения;
  • бессонница;
  • тошнота;
  • повышение температуры;
  • тахикардия или брадикардия.

Взаимодействие с другими лекарствами

Назальные капли на основе трамазолина и фенилэфрина не могут применяться, если проводится лечение других заболеваний ингибиторами МАО и антидепрессантами. Это объясняется тем, что совместный прием веществ такого рода повышает риск развития артериальной гипертензии.

Кроме того, не следует начинать лечить насморк Адрианолом на протяжении 10 суток после окончания употребления ингибиторов МАО (Бефол, Селегелин, Пиразидол и пр.).

к содержанию ?

Адрианол капли в нос для детей инструкция

Для деток выпускается Адрианол детский, в котором уменьшено содержание действующих веществ. Фенилэфрина и трамазолина гидрохлорид входят в него всего по 500 мкг, в то время как в лекарстве для взрослых концентрация этих действующих веществ составляет 1000 и 1500 мкг соответственно. Причем препарат может применяться даже для лечения грудничков.

Как использовать лекарственное средство зависит от возраста малыша. Так для детей до года достаточно ввести по 1 капле в каждый носовой ход. Процедуру рекомендуется проводить за полчаса до кормления, чтобы успело проявиться сосудосуживающее действие лекарства, и ребенок получил возможность спокойно поесть и заснуть.

Малышам от 1 до 5 лет достаточно введения 2 капель в каждую ноздрю трижды в сутки. А детям старше 5 лет, согласно аннотации, следует закапывать от 1 до 3 капель лекарственного средства до 4 раз в день. Тем не менее использовать Адрианол дольше 7 дней недопустимо, поскольку может возникнуть привыкание и медикаментозный ринит.[ads-pc-1][ads-mob-1] к содержанию ?

Адрианол при беременности: можно ли применять?

Специальных клинических исследований, направленных на выявление нежелательного воздействия на ребенка при приеме лекарства матерью во время беременности или кормления грудью, не проводилось. Поэтому инструкция не рекомендует использовать Адрианол в это время.

Тем не менее известно, что действующие вещества препарата оказывают в основном местное воздействие. А потому многие врачи советуют своим беременным пациенткам купить для носа Адрианол, особенно, если дама уже вошла в 3 триместр.

к содержанию ?

Адрианол при гайморите

Одним из самых распространенных ЛОР-заболеваний является гайморит, то есть воспаление верхнечелюстных или гайморовых пазух. Изначально это сопровождается:

  • насморком с выделением желтых или зеленых соплей;
  • заложенностью носа;
  • головными болями;
  • дискомфортом в области пораженных синусов.

По мере прогрессирования процесса интенсивность симптомов нарастает, а выходные отверстия из пазух закупориваются, следствием чего становится скопление в них слизи и гноя. Это вызывает появление чувства распирания в носу и сильных головных болей, которые еще более усиливаются при наклонах.

Известно, что Адрианол способствует устранению отека слизистой оболочки, для чего его и назначают при гайморите. Применение капель позволяет избавиться от заложенности носа и облегчить выведение скопившегося секрета из придаточных пазух, тем самым:

  • улучшить состояние больного;
  • предотвратить развитие осложнений;
  • подготовить носовые ходы для введения других лекарств или проведения пункции.

Тем не менее Адрианол не является единственным сосудосуживающим препаратом, назначаемым при гайморите. Он может быть заменен любым другим лекарственным средством, обладающим такими же свойствами.

Адрианол аналоги

Сегодня существует множество медикаментов, как спрей, так и капли, на основе фенилэфрина и трамазолина, но только в Адрианоле они содержатся вместе. Поэтому полных аналогов лекарства не существует, тем не менее есть масса медикаментов с МНН фенилэфрин. Это:

  • Виброцил;
  • Милт;
  • Эдем Рино;
  • Назол Кидс;
  • Аллергомакс и пр.

Адрианол или Виброцил

Оба препарата содержат сильный симпатомиметик фенилэфрин, но в отличие от Адрианола в состав Виброцила входит еще и антагонист Н1-рецепторов – диметинден. Благодаря этому результат после применения Виброцила наступает очень быстро и долго сохраняется.

Кроме того, такая комбинация действующих веществ обеспечивает наличие противоаллергического действия медикамента. Поэтому он эффективен и в отношении аллергического ринита, но при лечении гайморита это не имеет существенного значения. Поэтому оба лекарства могут использоваться с равной эффективностью.

Адрианол и Изофра

Поскольку заболевание имеет бактериальную природу, для уничтожения патогенной микрофлоры больным гайморитом часто назначают местный антибиотик Изофру, содержащий один из представителей группы аминогликозидов – фрамицетин.

Это соединение обладает выраженными антибактериальными свойствами и активно по отношению к большинству видов микроорганизмов, поражающих верхние дыхательные пути. Но применяться Изофра может только при отсутствии повреждений стенок носовых пазух.

Для повышения ее эффективности часто назначают предварительное промывание носовых ходов солевыми растворами и введение сосудосуживающего средства, в качестве которого может быть выбран и Адрианол.

Спустя 30 минут после этого допускается применение Изофры по 1 впрыскиванию в каждую ноздрю. Курс лечения обычно составляет 7–10 дней, если по истечении этого времени положительных результатов не наблюдается, лекарство отменяют и заменяют другим, активным в отношении прочих бактерий.

Но в любом случае назначение лекарственных средств при гайморите остается прерогативой отоларинголога, поскольку любое самолечение может только ухудшить состояние больного.

 

Поделитесь с друзьями

Оцените статью: Загрузка…

Адрианол капли назальные для взрослых 10 мл

Форма выпуска, состав и упаковка

Капли назальные 1 мл
фенилэфрина гидрохлорид 1 мг
тримазолина гидрохлорид 1.5 мг

Вспомогательные вещества: метилцеллюлоза М.Н.В. 10000, фенилртути (II) борат, этанол 96%, глицерол, аммиак водный, лимонной кислоты моногидрат, натрия гидрофосфата дигидрат, вода очищенная.

10 мл – флакон-капельницы пластиковые (1) – пачки картонные.

Капли назальные (для детей) 1 мл
фенилэфрина гидрохлорид 500 мкг
тримазолина гидрохлорид 500 мкг

Вспомогательные вещества: аммиак водный, глицерол, лимонной кислоты моногидрат, метилцеллюлоза М.Н.В. 10000, натрия гидрофосфата дигидрат, фенилртути (II) борат, этанол 96%, вода очищенная.

10 мл – флакон-капельницы пластиковые (1) – пачки картонные.

Клинико-фармакологическая группа: Сосудосуживающий препарат для местного применения в ЛОР-практике Регистрационные №№:

  • капли назальн. 1 мг+1.5 мг/1 мл: фл.-капельн. 10 мл – П N013655/01, 14.03.08
  • капли назальные (д/детей) 500 мкг+500 мкг/1 мл: фл.-капельн. 10 мл – П N013655/02, 14.03.08
    Описание лекарственного препарата АДРИАНОЛ® основано на официально утвержденной инструкции по применению препарата АДРИАНОЛ® для специалистов и утверждено компанией-производителем для издания 2008 года.
     |  Показания  |  Режим дозирования  |  Побочное действие  |  Противопоказания  |  Условия отпуска из аптек  |  Условия хранения и сроки годности
    Показания к применению препарата АДРИАНОЛ®

    Острый и хронический ринит, синусит.

    Применяется в качестве вспомогательного противоотечного средства во время диагностических процедур и хирургических манипуляций.

    Режим дозирования

    Взрослые и дети школьного возраста: по 1-3 капли в каждый носовой ход 4 раза в день.

    Дети от 1 до 5 лет (детская форма): по 2 капли в каждый носовой ход 3 раза в день. Дети грудного возраста (детская форма): по 1 капле в каждый носовой ход за 30 минут до начала кормления.

    Длительность применения препарата – не более 1 недели, затем необходим перерыв на несколько дней.

    Побочное действие

    Побочные явления возникают редко и проявляются в виде жжения, болезненности или сухости слизистой оболочки носа.

    Противопоказания к применению препарата АДРИАНОЛ®

    — повышенная индивидуальная чувствительность;

    — тиреотоксикоз;

    — феохромоцитома;

    — глаукома;

    — тяжелые поражения почек;

    — артериальная гипертензия;

    — ишемическая болезнь сердца;

    — атрофический ринит;

    — атеросклероз.

    Применение при нарушениях функции почек

    Адрианол нельзя применять при тяжелых поражениях почек.

    Условия отпуска из аптек

    Препарат разрешен к применению в качестве средства безрецептурного отпуска.

    Условия и сроки хранения

    Хранить в сухом, защищенном от света, недоступном для детей месте при температуре не выше 25°С.

    Срок годности – 3 года. Не использовать по истечении срока годности.

капли в нос для детей

Насморк появляется как у деток, так и у взрослых по разным причинам. Это может быть и аллергическая реакция, и проявление простудных заболеваний. Для облегчения этого неприятного состояния, связанного с простудой, придумано множество препаратов, как на основе сырья растительного происхождения, так и с химическими компонентами. Адрианол – это капли в нос для детей любого возраста, которые рекомендуют многие педиатры.

Действующее вещество и дозировка

Эти капли относятся к категории сосудосужающих препаратов, что гарантирует снижение отека слизистой оболочки и облегчает дыхание. Действующими веществами Адрианола для детей являются тримазолин и фенилэфрин, которые отлично себя зарекомендовали при лечении острого и хронического ринита, синусита, а также при подготовке к отоларингологическим операциям или процедурам. Для детей капли Адрианол выпускаются во флаконах с дозировкой тримазолина гидрохлорида и фенилэфрин гидрохлорида по 500 мкг.

Инструкция по применению Адрианола для детей

В зависимости от возраста малыша эти капли назначаются в разных дозировках:

  • для новорожденных и карапузов до года рекомендуется применять препарат за полчаса перед каждым кормлением (не чаще 4 раз в сутки) в дозировке: 1 капля в каждый носовой проход;
  • для малышей дошкольного возраста (от года до пяти лет) лекарство следует применять по схеме: по две капли Адрианола в каждый из носовых проходов три раза в день;
  • для ребят старше пятилетнего возраста препарат применяют 4 раза в день по три капли в каждый из носовых проходов.

Кроме этого, стоит учесть тот факт, что, как и любые капли, Адрианол для детей может вызвать привыкание, поэтому его не рекомендуют беспрерывно использовать более недели.

Побочные действия и противопоказания

Если внимательно изучить инструкцию, то Адрианол для детей не может быть использован, если у ребенка есть аллергия на компоненты лекарства, а также при наличии следующих заболеваний:

  • артрофический ринит;
  • патология почек;
  • глаукома;
  • феохромоцитома;
  • артериальная гипертензия;
  • тиреотоксикоз;
  • ИБС.

Помимо этого, как и у любых капель в нос, у Адрианола для детей в инструкции прописаны побочные действия. Прием этого препарата может вызвать зуд, жжение, болезненность слизистых оболочек носа и его сухость. При проявлении этих симптомов капли применять прекращают, и, по возможности, обращаются к врачу за консультацией.

Подводя итог, хочется отметить, что любой лекарственный препарат должен назначаться доктором. Но если нет возможности его посетить, и принято решение лечить ребенка самостоятельно, то необходимо следить за симптоматикой течения заболевания и принимать капли в той дозировке, которая рекомендована вашему малышу по возрасту.

 

Капли Адрианол, инструкция по применению для детей и взрослых

Изменено: 20 июня 2018

Каждый знает, что такое заложенность носа. Запах еды, спокойный сон, приятные ароматы – все становится недоступным. С этим симптомом поможет справиться Адрианол, представляющий собой назальные капли без резкого запаха и цвета, хорошо переносимый всеми членами семьи препарат.

Состав и форма выпуска

Активными компонентами Адрианола являются фенилэфрина гидрохлорид (0, 012 гр) и тримазолина гидрохлорид (0,01 гр). Эта концентрация предназначена для взрослых. Также Адрианол производят в форме капель для детей, дозировка каждого действующего вещества в них равна 0,005 гр.

В инструкции к Адрианолу также приведены вспомогательные компоненты, помогающие стабилизировать средство. Это натрия гидрофосфата дигидрат, этанол, метилцеллюлоза, глицерол, увлажняющий слизистую носа и защищающий ее от пересушивания.

Назальные капли в нос Адрианол выпускаются во флаконе-капельнице объемом 10 мл.

Фармакологическое действие

Основное действие фенилэфрина и тримазолина – сосудосуживающее и противоотечное. Дыхание восстанавливается уже спустя пару минут, отек спадает, человек начинает дышать. За счет метилцеллюлозы (а именно она дает тягучесть раствору) эффект продолжается до шести часов после закапывания. Вспомогательные вещества также защищают слизистую от сухости, что очень важно при лечении насморка.

Благодаря активным компонентам препарата давление начинает падать в придаточных пазухах носа и даже в среднем ухе. Данный фактор защищает пазухи от попадания инфекции и препятствует ее дальнейшему распространению.

Показания и противопоказания

Применение капель для носа Адрианол возможно при:

Согласно инструкции по применению, капли Адрианол противопоказаны в следующих случаях:

  • повышенная чувствительность к компонентам препарата;
  • индивидуальная непереносимость веществ;
  • в анамнезе атрофический ринит или предрасположенность к нему;
  • приступы ишемической болезни сердца и их осложнения;
  • тиреотоксикоз в средней и тяжелой форме;
  • артериальная гипертензия в средней и тяжелой форме и ее осложнения;
  • повышенное внутриглазное давление, глаукома;
  • заболевания почек и их тяжелые поражения.

Инструкция по применению и дозировка

В инструкции по применению к Адрианолу сказано, что дозировка вещества зависит от возраста больного, а также от тяжести заболевания.

Так, грудничкам детский Адрианол необходимо закапывать по 1 капле в каждый носовой ход, желательно за 20-30 минут до кормления грудью. Предварительно стоит промыть нос ребенка солевым раствором или Аквамарисом и убрать слизь аспиратором.

С 1 года до 6 лет рекомендуется закапывать по 2 капли до 3-4 раз в сутки. Адрианол для детей имеет меньшую концентрацию, чем взрослый, что дает возможность использовать капли по требованию и самим регулировать количество закапываний. Конечно же, придерживаясь допустимых норм.

С 6 лет детям и их родителям уже можно капать до 3 капель за раз, по 3-4 раза в день. Дозировка вещества для взрослых будет содержать в два раза больше действующих компонентов, чем указано в инструкции к детскому Адрианолу, что тоже стоит учитывать при использовании капель.

В отличие от других сосудосуживающих средств, Адрианол можно использовать при беременности. При возникновении сухости в носу и развитии других нежелательных реакций, следует прекратить прием препарата. Концентрация Адрианола при беременности должна быть той же, что и в каплях для носа, предназначенных для детей. Это нужно учитывать при дозировании и количестве закапываний в течение дня.

В инструкции к Адрианолу для детей и взрослых также имеется информация о длительности использования лекарственного средства. Не стоит применять препарат дольше недели.

Если же есть показания к использованию препарата в течение длительного времени, необходим семидневный перерыв. Это обязательное условие при лечение Адрианолом необходимо соблюдать, чтобы избежать атрофию сосудов и развитие устойчивости организма к компонентам лекарственного средства.

Побочные эффекты

Средство хорошо переносится пациентами разного возраста. Но стоит иметь в виду, что при повышенной чувствительности организма побочные действия все же могут наблюдаться. Информация о передозировке препаратом отсутствует. К нежелательным эффектам средства относятся в первую очередь реакции местного характера.

 К ним относятся:

  • сухость слизистой оболочки носа и жжение;
  • болезненность;
  • зуд.

Эффектами общего действия, проявляющиеся намного реже, являются:

  • тошнота, рвота;
  • головная боль, головокружение;
  • повышение артериального давления;
  • тахикардия, одышка;
  • аллергические реакции (крапивница, отек Квинке).

При несоблюдении дозировки веществ, а также длительном применении возможны атрофия слизистой оболочки носа, постоянная заложенность, воспаление носа и носовых пазух. Поэтому ни в коем случае нельзя самостоятельно принимать решение о применении капель Адрианол. Специалист поможет подобрать подходящее средство.

Изучая инструкцию по применению препарата, необходимо обратить внимание на возможность использования капель в нос Адрианол совместно с другими лекарственными средствами. К примеру, данное средство нельзя использовать с ингибиторами моноаминоксидазы. Также запрещается использование Адрианола совместно с антидепрессантами: в этом случае высок риск развития артериальной гипертензии, вплоть до гипертонического криза.

Аналоги

У Адрианола нет абсолютных аналогов. Существует множество препаратов с похожим сосудосуживающим действием, но они отличаются по составу и концентрации активных веществ.

Можно сравнить с этим средством такие препараты, как Отривин, Ксимелин, Риностоп, Називин. Но они относятся не к аналогам Адрианола, а к препаратам, относящимся к одной с ним фармакологической группе.

Итак, Адрианол — эффективное сосудосуживающее средство, которое быстро и надолго избавит от заложенности носа. Тот факт, что этот препарат разрешен к применению у грудных детей, говорит о его безопасности, что очень ценится мамами и педиатрами.

Автор: Оксана Акуличева, врач,
специально для Moylor.ru

Полезное видео об осторожности при приеме сосудосуживающих капель в нос

УФ-спектры поглощения а) Адрианола (А) и Адрианола-Т (Б) назальные…

Контекст 1

… УФ-спектры тримазолина и фенилэфрина гидрохлорида в водной среде и УФ-спектр Адрианола Т показаны на рис. 2. В частности, оптическую плотность при 265 нм для тримазолина гидрохлорида и при 272 нм для фенилэфрина гидрохлорида считали оптимальными рабочими длинами волн для их определения. Наилучший линейный отклик на концентрацию аналита достигается при использовании этих длин волн.Кривая регрессии рассчитывалась методом наименьших квадратов. Закон Бера соблюдался в диапазоне концентраций от 10 до 60 мкг см -3 тримазолина гидрохлорида и фенилэфрина гидрохлорида. Спектры поглощения тримазолина гидрохлорида и фенилэфрина гидрохлорида не изменялись в присутствии обычных вспомогательных веществ, используемых в фармацевтических препаратах. Было обнаружено, что рассчитанные значения t (0,814 для гидрохлорида тримазолина при 265 нм и 1,45 для гидрохлорида фенилэфрина при 275 нм) меньше, чем табличные значения t (2.225). Поэтому предлагаемый аналитический метод является специфичным и селективным в отношении препарата. Было обнаружено, что диапазон линейности для гидрохлорида тримазолина при оценке при 265 нм составляет 10–60 мкг см -3 ( r = 0,9992) и 10–60 мкг см -3 ( r = 0,9993) для гидрохлорида фенилэфрина при 275 нм. Достоверность соответствия уравнений регрессии подтверждалась высокими значениями коэффициента регрессии. Точность колебалась от 40 до 60 г см . Отличные средние значения процентного восстановления, близкие к 100 %, и их низкие значения стандартного отклонения (SD < 1.0) представляют собой высокую точность аналитических методов. Валидность и надежность предложенных методов оценивали по восстановительным исследованиям. Среднее процентное извлечение (RSD) для более низких, средних и высоких концентраций составило 99,63 (40 мкг см-3), 99,50 (50 мкг см-3) и 100,08 (60 мкг см-3) для гидрохлорида тримазолина. и 100,57 (40 мкг см-3), 99,60 (50 мкг см-3) и 100,33 (60 мкг см-3) для гидрохлорида фенилэфрина соответственно. Валидность и надежность предложенных методов дополнительно оценивались исследованиями извлечения с помощью стандартного метода добавления.Среднее процентное восстановление для концентрации от 50 мкг см -3 составило 99,74 (0,58), 100,50 (0,64) и 99,84 (0,53) для тримазолина гидрохлорида и 100,53 (0,61), 100,87 (0,49) и 99,04 (0,73) для гидрохлорида фенилэфрина соответственно. Эти результаты показали, что любое небольшое изменение концентрации лекарственного средства в растворах может быть точно определено предложенным аналитическим ...

Фенилэфрин – обзор | ScienceDirect Topics

Сердечно-сосудистые заболевания

Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и Национальный реестр лекарственно-индуцированных глазных побочных эффектов (Институт глаза Кейси, Портленд, штат Орегон) получили 11 сообщений о неблагоприятных системных реакциях на однократную дозу фенилэфрина 10% для местного применения в виде вкладыша. форма [4].Было восемь мужчин и три женщины в возрасте от 1 до 76 лет. Большинство пациентов отмечали системные эффекты в течение нескольких минут после применения фенилэфрина, а побочные системные реакции включали тяжелую гипертензию, отек легких, сердечные аритмии, остановку сердца и субарахноидальное кровоизлияние.

В метаанализе побочных реакций со стороны сердечно-сосудистой системы на местное применение фенилэфрина 2,5% или 10% в восьми рандомизированных контролируемых исследованиях с участием 916 участников ни артериальное давление, ни частота сердечных сокращений не изменились после 0.25% фенилэфрина либо через 20–30 минут, либо через 60 минут [5]. Артериальное давление повысилось через 5 и 10 минут после применения 10% фенилэфрина (средняя разница 15 мм рт. ст.; 95% ДИ = 12, 19), но упало до исходного уровня через 20–30 минут. Частота сердечных сокращений увеличилась на 5 ударов в минуту (95% ДИ = 1, 8) через 20–30 минут и вернулась к исходному уровню через 60 минут.

10% раствор фенилэфрина иногда вызывал чрезвычайно тяжелые сердечно-сосудистые осложнения, включая инфаркт миокарда.

У новорожденных пользу от точной оценки гестационного возраста путем исследования передней сосудистой капсулы хрусталика и ценность исследования глазного дна у больных недоношенных детей следует сопоставлять с возможным риском связанного с этим повышения артериального давления, вызванного зрачковой расширители.Поскольку не происходит усиления мидриатического эффекта при повторных инстилляциях или увеличении концентрации, а их небольшая масса тела подвергает недоношенных новорожденных повышенному риску передозировки фенилэфрина, разумно использовать самую низкую возможную концентрацию, а также наиболее эффективную комбинацию мидриатиков для непрямая офтальмоскопия у недоношенных детей, когда такое обследование абсолютно необходимо. Гипертензивный эффект, вероятно, будет максимальным в течение первых 20 минут, и по возможности (или при наличии факторов риска) следует контролировать артериальное давление.

После глазного применения фенилэфрина у здорового 2-летнего ребенка развился тяжелый гипертонический криз [6].

Селективный агонист α-адренорецепторов фенилэфрин используется в некоторых клинических условиях для купирования гипотензии. Примером может служить спинальная анестезия при кесаревом сечении, как описано в отчете о сердечных аритмиях [7].

Женщине 31 года, которой потребовалось экстренное кесарево сечение из-за отсутствия прогресса в родах, сразу после интратекального введения бупивакаина и диаморфина ввели 200 мкг фенилэфрина в виде инфузии; дозу повторяли всякий раз, когда кровяное давление падало ниже исходного уровня.В течение нескольких секунд после начала инфузии у нее развилась желудочковая бигеминия с частотой 94 в минуту, которая сохранялась до родов, синусовый ритм вернулся без лечения. Артериальное давление было от 122/76 до 143/80 мм рт.ст.

Механизм этого эффекта неясен. Авторы предположили, что могла иметь место повышенная постнагрузка, что привело к увеличению растяжения желудочков, но это было спекулятивно.

У ребенка после интраоперационного введения глазного фенилэфрина развились сердечные аритмии, выраженная артериальная гипертензия, отек легких [1].

У 2-месячного ребенка, которому во время экстракции катаракты вводили периоперационные капли фенилэфрина, развились желудочковые экстрасистолы, очень тяжелая артериальная гипертензия и отек легких, требующие интенсивной терапии [8]. Экстубация была возможна в течение 3 часов, и она выздоровела без неблагоприятных последствий.

Авторы отметили, что изменения артериального давления хорошо описаны при применении глазных капель фенилэфрина, особенно у младенцев. Ясно, что у этих очень молодых пациентов трудно определить точную дозировку, и они предположили, что микрокапли могут быть более безопасным способом введения.

Капли фенилэфриновые глазные используются для расширения зрачков с целью проведения офтальмоскопии и используются у новорожденных при офтальмологическом обследовании для оценки наличия ретинопатии недоношенных. Тем не менее, это может вызвать серьезные сердечно-сосудистые побочные эффекты. У 42 новорожденных не было побочных эффектов фенилэфрина 2,5% в сочетании с 0,5% глазными каплями тропикамида на частоту сердечных сокращений или артериальное давление [9].

Повышение артериального давления, которое вызывает фенилэфрин, само по себе может быть опасным, даже если он не применяется системно или, по крайней мере, не преднамеренно [10].

У 23-летнего афроамериканца в результате серповидно-клеточной анемии развился ишемический приапизм. После интракавернозного введения фенилэфрина 500 мкг он жаловался на очень сильную головную боль, КТ показала субарахноидальное кровоизлияние. Его кровяное давление составляло 180/100 мм рт.ст. по сравнению с его исходным показателем 130/88 мм рт.ст. Ему дали эналаприл (доза не указана), и его кровяное давление упало. К счастью, ни тогда, ни позже у него не было неврологических симптомов.

Авторы весьма обоснованно предложили снизить стандартную дозу для инъекций в этих обстоятельствах до 200 мкг, при необходимости повторить.

Антитела к коронавирусу Хорошо. Искусственные молекулы лучше?

Коронавирус может быть новым, но природа давно дала людям инструменты для его распознавания, по крайней мере, в микроскопическом масштабе: антитела, Y-образные иммунные белки, которые могут цепляться за патогены и блокировать их проникновение в клетки.

Миллионы лет эволюции превратили эти белки в оружие для борьбы с болезнями, которым они и являются сегодня.Но всего за несколько месяцев комбинация человеческого и машинного интеллекта, возможно, обыграла Мать-природу в ее собственной игре.

Используя вычислительные инструменты, группа исследователей из Вашингтонского университета разработала и построила с нуля молекулу, которая при противодействии коронавирусу в лаборатории может атаковать и изолировать его, по крайней мере, так же хорошо, как это делает антитело. При попадании в носы мышей и хомяков он также защищает животных от серьезных заболеваний.

Эта молекула, называемая мини-связующим из-за ее способности связываться с коронавирусом, является миниатюрной и достаточно стабильной, чтобы ее можно было массово отправлять в лиофилизированном состоянии.Бактерии также могут производить эти мини-связующие, что потенциально делает их не только эффективными, но и дешевыми и удобными.

Продукт команды все еще находится на очень ранней стадии разработки и не появится на рынке в ближайшее время. Но пока «это выглядит очень многообещающе», — сказала Лорен Картер, один из исследователей проекта, которым руководит биохимик Дэвид Бейкер. В конце концов, здоровые люди смогут самостоятельно вводить мини-биндеры в виде назального спрея и потенциально сдерживать любые проникающие частицы коронавируса.

«Самым элегантным приложением может быть то, что вы держите на прикроватной тумбочке», — сказала мисс Картер. «Это своего рода сон».

Мини-биндеры не являются антителами, но они препятствуют распространению вируса во многом сходным образом. Коронавирус проникает в клетку, используя своего рода взаимодействие «замок-ключ», соединяя белок, называемый шипом — ключом, — с молекулярным замком, называемым ACE-2, который украшает внешнюю сторону некоторых клеток человека. Антитела, вырабатываемые иммунной системой человека, могут вмешиваться в этот процесс.

Многие ученые надеются, что массовое производство имитаторов этих антител может помочь лечить людей с Covid-19 или предотвратить их заболевание после заражения. Но нужно много антител, чтобы обуздать коронавирус, особенно если заражение уже идет. Антитела также обременительны для производства и доставки людям.

Чтобы разработать менее привередливую альтернативу, сотрудники лаборатории Бейкера во главе с биохимиком Лунсин Цао применили вычислительный подход. Исследователи смоделировали, как миллионы гипотетических белков, разработанных в лаборатории, будут взаимодействовать с шипом.После последовательного отсеивания неудовлетворительных результатов команда выбрала лучших из всех и синтезировала их в лаборатории. Они неделями переключались между компьютером и рабочим столом, возясь с конструкциями, максимально приближенными к симуляции и реальности.

Результатом стал полностью самодельный мини-биндер, который легко приклеивался к вирусу, сообщила команда в журнале Science в прошлом месяце.

«Это шаг вперед, чем просто построение из натуральных белков», — сказал Ашер Уильямс, инженер-химик из Корнельского университета, не участвовавший в исследовании.Если бы его адаптировали для других целей, добавил доктор Уильямс, «это было бы большой победой для биоинформатики».

В настоящее время команда возится с алгоритмами глубокого обучения, которые могли бы научить компьютеры лаборатории оптимизировать повторяющийся процесс проб и ошибок при проектировании белков, что позволит получать продукты за недели, а не за месяцы, сказал доктор Бейкер.

Но новизна подхода с мини-переплетом также может быть недостатком. Возможно, например, что коронавирус может мутировать и стать устойчивым к D.И.Ю. молекула.

Даниэль-Адриано Сильва, биохимик из биофармацевтической компании Neoleukin из Сиэтла, который ранее обучался у доктора Бейкера в Вашингтонском университете, возможно, придумал другую стратегию, которая могла бы решить проблему резистентности.

Его команда также разработала белок, который может предотвратить вторжение вируса в клетки, но их самостоятельная работа не помогла. молекула немного более знакома. Это уменьшенная и более прочная версия человеческого белка ACE-2, который имеет гораздо более сильное сцепление с вирусом, поэтому молекула потенциально может служить приманкой, которая отвлекает патоген от уязвимых клеток.

Пандемия коронавируса: что нужно знать


Карточка 1 из 3

Невакцинированные городские рабочие. Ожидается, что 11 февраля Нью-Йорк уволит до 3000 муниципальных служащих, включая полицейских, пожарных и учителей, за отказ пройти вакцинацию от коронавируса — возможно, это крупнейшее сокращение рабочих в стране, связанное с мандатом на вакцинацию.

Развитие устойчивости было бы бесполезным, сказал Кристофер Барнс, структурный биолог из Калифорнийского технологического института, который сотрудничал с Нелейкиным в их проекте.Штамм коронавируса, который больше не может быть связан с приманкой, вероятно, также потеряет способность связываться с настоящей вещью, человеческой версией ACE-2. «Это большая цена для вируса», — сказал доктор Барнс.

Мини-биндеры и ложные ACE-2 легко изготовить, и они, вероятно, будут стоить всего несколько центов на доллар по сравнению с синтетическими антителами, цена которых может достигать нескольких тысяч долларов, сказала г-жа Картер. И в то время как антитела должны храниться в холоде, чтобы сохранить долголетие, D.И.Ю. белки могут быть сконструированы таким образом, чтобы они прекрасно функционировали при комнатной температуре или даже в более экстремальных условиях. Мини-связку Вашингтонского университета «можно кипятить, и это все еще нормально», — сказал доктор Цао.

Благодаря такой прочности эти молекулы легко транспортировать и вводить различными способами, например, вводя их в кровоток для лечения продолжающейся инфекции.

Две молекулы-конструктора также задействуют вирус в сверхплотном сжатии, позволяя меньшему делать больше.«Если у вас есть что-то, что хорошо связывает это, вам не нужно использовать столько», — сказал Аттабей Родригес Бенитес, биохимик из Мичиганского университета, который не участвовал в исследовании. «Это означает, что вы получаете больше отдачи от затраченных средств».

Обе исследовательские группы изучают свои продукты как потенциальные средства не только для борьбы с инфекцией, но и для ее прямого предотвращения, что-то вроде недолговечной вакцины. В серии экспериментов, описанных в их статье, команда Neoleukin распыляла свою приманку ACE-2 в носы хомяков, а затем подвергала животных воздействию коронавируса.Нелеченые хомяки серьезно заболели, но хомяки, которым вводили назальный спрей, чувствовали себя намного лучше.

Мисс Картер и ее коллеги в настоящее время проводят аналогичные эксперименты со своей мини-папкой и получают сопоставимые результаты.

Исследователи предупредили, что эти результаты могут не распространяться на людей. И ни одна из команд еще не разработала идеальный способ введения своих продуктов животным или людям.

В будущем у двух типов дизайнерских белков еще могут появиться возможности для совместной работы — если не в одном продукте, то, по крайней мере, в одной войне, пока бушует пандемия.«Это очень дополняет друг друга», — сказала г-жа Картер. Если все пойдет хорошо, подобные молекулы могут присоединиться к растущему арсеналу мер общественного здравоохранения и лекарств, уже существующих для борьбы с вирусом, сказала она: «Это еще один инструмент, который вы могли бы иметь».

[ Нравится страница Science Times на Facebook. | Подпишитесь на информационный бюллетень Science Times . ]

Как одна компания перешла от рака к коронавирусу и за 10 недель разработала лекарство, блокирующее вирусы , не может выйти на работу, но не совсем уверен, как продуктивно работать из дома.Мы пекли горы хлеба, убирали квартиры или смотрели Netflix.

Тем временем сотрудники биотехнологического стартапа Neoleukin Therapeutics в свободное время изобрели новую молекулу, блокирующую коронавирус от заражения клеток. Его можно вводить в виде назального спрея, и испытания на хомяках показали, что он защищает животных от болезней.

«Мы увидели возможность изменить мир к лучшему и эффективно использовать свое время, — сказал Даниэль-Адриано Силва, вице-президент по исследованиям компании Neoleukin.«Мы полны энтузиазма и очень рады тому, что мы здесь сделали».

Даниэль-Адриано Сильва из Neoleukin Therapeutics с моделью молекулы, разработанной компанией для … [+] лечения рака без побочных токсических эффектов

Неолейкин терапия

Neoleukin (NASDAQ:NLTX) была создана в январе 2019 года с целью создания дизайнерских молекул против раковых клеток. Компания Neoleukin, дочерняя компания Института дизайна белков Вашингтонского университета, использует технологию компьютерного моделирования для разработки белковых фрагментов, называемых пептидами, которые будут складываться в желаемую форму, а также прочно связываться с выбранной целью.

Названный « de novo белковый дизайн», этот метод представляет собой революционный сдвиг в способах разработки лекарств. Вместо того, чтобы искать молекулы в природе, которые могут лечить болезни, а затем пытаться оптимизировать их для безопасности, эффективности и массового производства, дизайн de novo позволяет исследователям создавать молекулы на заказ для выполнения определенной функции.

Хотя компания была запущена для создания молекул для борьбы с раком, эта стратегия одинаково хорошо работает и против инфекционных заболеваний.Дизайнерский антивирус был создан в рекордно короткие сроки и является самым сложным рабочим белком, когда-либо разработанным и созданным людьми с нуля.

«Вот потенциальный способ изменить ход этой пандемии», — сказал Сильва. «Я считаю, что если мы установим эту стратегию в качестве жизнеспособной технологии для борьбы с этой пандемией, ее можно будет использовать для воздействия на течение других вспышек в будущем».

Связывание белков зависит от формы, как кусочки 3D-пазла, которые аккуратно соединяются друг с другом, а также от химических сил.Представьте, что внутри кусочков пазла есть магниты. Если заряды не выровнены, кусочки не встанут на место, даже если физические поверхности совпадают.

Ученые Neoleukin увидели возможность применить свою технологию моделирования белков к новому коронавирусу. Белок шипа на поверхности вируса связывается с белком на поверхности клетки, называемым ACE2. Чтобы вирус не попал в клетку, нужно просто создать что-то, что блокирует часть спайкового белка, связывающую ACE2.

Традиционный подход к отражению вируса заключается в создании моноклональных антител, которые приклеиваются к вирусному белку. Экспериментальная терапия, назначенная президенту Трампу, является примером моноклонального антитела, как и недавно одобренный препарат бамланивимаб. Моноклональные антитела отлично сливаются со своими мишенями, но по молекулярным стандартам они гигантские. Они прикрепляются к большему количеству частей вируса, чем только часть, которая связана с ACE2.

Это означает, что вирус может мутировать таким образом, что лекарство сделает его менее узнаваемым, но это не помешает его способности связываться с ACE2 и инфицировать клетку.Это называется «мутационным побегом», и это объясняет, почему некоторые лекарства, которые поначалу действуют как гангстеры, со временем могут перестать быть эффективными.

Neoleukin разработал крошечный пептид, который точно соответствует той части белка ACE2, которая связывает спайковый белок коронавируса. Любое изменение, которое ослабляет связь между пептидом и вирусом, также ослабляет способность вируса инфицировать клетку. А когда пептид присутствует, с ним связывается шиповидный белок вируса вместо белка ACE2, предотвращая инфекцию.

Модели белка ACE2 и дизайнерского пептида, созданного Neoleukin, под названием CTC-445. Сайты … [+], где они связываются с белком Spike, идентичны. «CTC» означает «Покорение короны».

Неолейкин терапия

«Все взаимодействия, которые происходят, такие же, как взаимодействие вируса с ACE2», — сказал Томас Лински, директор Neoleukin по дизайну белков. «Это затрудняет выход вируса».

Процесс проектирования выглядит примерно так.Основываясь на опубликованной последовательности белка шиповидного белка коронавируса, исследователи используют свое программное обеспечение для проектирования белков для создания имитаторов, которые будут связывать соответствующую часть шиповидного белка. «Для этого проекта мы разработали более 35 000 последовательностей на компьютере, — сказал Лински.

Из этих тысяч кандидатов 198 пептидов были оценены в лаборатории, чтобы измерить, насколько хорошо они могут связываться с шиповидным белком в биологических условиях. «Мы много думали о том, как выбрать наилучшие возможные конструкции, которые имеют наилучшие шансы на успех», — сказал Лински.Как только главные претенденты определены, происходит большая оптимизация. С помощью процесса, называемого «направленной эволюцией», исследователи создают множество похожих пептидов, каждый из которых немного отличается, и выбирают, насколько хорошо они связываются с шиповидным белком. Эффективное противовирусное средство должно привлекать шиповидный белок даже в присутствии ACE2, предотвращая его связывание с белком на поверхности клетки и инфицирование клетки.

Противовирусное средство можно вводить в виде назального спрея.

гетти

«Как только мы выяснили, что это действительно работает, мы обратились к живому вирусу и подтвердили, что это очень эффективный способ подавления вируса», — сказал Сильва. Это не только предотвратило заражение вирусом клеток человека, выращенных в чашке, но и сработало на хомяках в назальном спрее. Пролеченные хомячки получили смертельную дозу SARS-CoV-2, и все выжили.

На данный момент компания все еще оценивает логистику массового производства молекулы. У них пока нет плана по разработке его для распространения, но потенциально они могли бы сотрудничать с производителем, если бы такая договоренность была осуществима.«Как компания, которая занимается производством белков для лечения рака и аутоиммунных заболеваний, это немного выходит за рамки нашей сферы деятельности», — сказал Джонатан Драхман, генеральный директор Neoleukin. «Это интересно, но мы должны оценить, есть ли смысл для нас пытаться его развивать».

Аэрозоли передают прионы иммунокомпетентным и иммунодефицитным мышам

Образец цитирования: Haybaeck J, Heikenwalder M, Klevenz B, Schwarz P, Margalith I, Bridel C, et al. (2011) Аэрозоли передают прионы иммунокомпетентным и иммунодефицитным мышам.PLoS Патог 7(1): е1001257. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1001257

Редактор: David Westaway, Университет Альберты, Канада

Получено: 22 марта 2010 г.; Принято: 13 декабря 2010 г.; Опубликовано: 13 января 2011 г.

Авторские права: © 2011 Haybaeck et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.

Финансирование: Эта работа была частично поддержана грантами ЕС ANTEPRION и PRIORITY (LS), а также TSE-Forschungsprogramm des Landes Baden-Wuerttemberg, Germany (LS). Эта работа также была поддержана грантами Министерства окружающей среды, продовольствия и сельского хозяйства Великобритании (AA), грантами ЕС LUPAS и PRIORITY (AA), Исследовательским фондом Novartis (AA) и грантом Advanced Grant Европейского исследовательского совета для АА. MH был поддержан Фондом исследований на медицинском факультете, проф.Фонд доктора Макса-Клоэтты и Фонд Боницци-Телер. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Трансмиссивные губчатые энцефалопатии (ТГЭ) — фатальные нейродегенеративные заболевания, поражающие людей и различных млекопитающих, включая крупный рогатый скот, овец, оленей и лосей.TSE характеризуются превращением клеточного прионного белка (PrP C ) в неправильно уложенную изоформу, называемую PrP Sc [1]. Агрегация PrP Sc связана с глиозом, спонгиозом и нейродегенерацией [2], что неизменно приводит к летальному исходу. Давно известно, что прионные заболевания являются трансмиссивными [3], и передача прионов может происходить после перорального, роговичного, внутрибрюшинного (в/б), внутривенного (в/в), интраназального (в/м), внутримышечного (в/м), внутриязыкового, чрескожного и внутримозгового (в/б) введения. .в) применение, наиболее эффективным из которых является в. прививки [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Некоторые биологические жидкости и экскременты (например, слюна, молоко, моча, кровь, плацента, фекалии) содержат значительные уровни инфекционности прионов [13], [14], [15], [16], [17], и считается, что горизонтальная передача иметь решающее значение для естественного распространения ТГЭ [18], [19], [20], [21], [22], [23]. Животные, находящиеся на свободном выгуле, могут поглощать инфекционные частицы приона при кормлении или питье [24], [25], а раны на языке могут представлять собой места проникновения прионов [26].

PrP Sc также был обнаружен в обонятельном эпителии пациентов с сБКЯ [27], [28]. Прионная колонизация носового эпителия встречается у разных видов и с разными прионными штаммами [11], [12], [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35]. , [36], [37]. В модели прионов HY-TME интраназальное введение в 10–100 раз эффективнее перорального приема [29] и, как и во многих других экспериментальных парадигмах [38], [39], [40], [41], [42] , [43], [44], лимфоретикулярная система (LRS) является самым ранним местом отложения PrP Sc .В одной публикации продемонстрирована передача хронического истощения (ХБО) цервидизированным мышам через аэрозоли и при интраназальной инокуляции [45], однако в двух исследованиях сообщалось о диаметрально различающихся результатах о роли обонятельного эпителия или ЛРС в патогенезе прионов при интраназальной инокуляции прионов [11]. ], [12], возможно, из-за разных используемых прионных штаммов и животных моделей. Эти разногласия указывают на то, что механизмы интраназальной и аэрозольной прионной инфекции до конца не изучены.Кроме того, интраназальное введение физически сильно отличается от воздушной передачи прионов, поскольку проникновение в дыхательные пути капель, содержащих прион, может радикально различаться при этих двух способах введения.

Здесь мы проверили клеточные и молекулярные характеристики распространения прионов после воздействия аэрозоля и после интраназального закапывания. Мы обнаружили, что оба пути инокуляции в значительной степени не зависят от иммунной системы, даже несмотря на то, что мы использовали сильно лимфотропный штамм приона.Аэрозоли оказались эффективными переносчиками прионов у мышей, при этом трансмиссивность в основном определялась периодом воздействия, уровнем экспрессии PrP C и титром прионов.

Результаты

Передача прионов через аэрозоли

Прионные аэрозоли получали с помощью распылителя с гомогенатами мозга в концентрациях 0,1–20% (далее всегда указывается весовое/объемное процентное содержание), полученными от неизлечимо больных скрепи или здоровых мышей, и вводили в ингаляционную камеру.Согласно спецификациям производителя, аэрозольные частицы имели максимальный диаметр <10 мкм, и примерно 60% были <2,5 мкм [46].

Группы мышей со сверхэкспрессией PrP C ( tg a 20 ; n = 4–7) подвергались воздействию аэрозолей прионов, полученных из инфицированных или здоровых гомогенатов мозга (далее IBH и HBH) в различных концентрациях (0,1, 2,5, 5, 10 и 20%) в течение 10 мин (рис. 1А, табл. 1). Все tg a 20 мышей подверглись воздействию аэрозолей, полученных из IBH (концентрация: ≥2.5%) поддались скрепи с показателем атаки 100%. Время инкубации отрицательно коррелировало с концентрацией ИБГ (2,5%: n = 4, 165±54 dpi; 5%: n = 4, 131±7 dpi; 10%: n = 5, 161±27 dpi; 20%: n = 5, 161±27 dpi; = 6, 133±8 dpi, p  = 0,062, стандартная линейная регрессия по стандартному ANOVA, рис. 1А и F, таблица 1, таблица S1A).

Рисунок 1. Передача прионов через аэрозоли.

( A ) tg a 20 мышей подвергали воздействию аэрозолей, образующихся из 0,1%, 2.5%, 5%, 10% или 20% гомогенатов мозга мыши инфицированных прионами (IBH) в течение 10 мин. ( B ) Группы из tg a 20 и ( C ) мышей CD1 подвергались воздействию аэрозолей, образующихся из 20% IBH, в течение 1, 5 или 10 минут. Опыты проводились дважды (разные цвета). ( D ) C57BL/6, ( E ) 129SvxC57BL/6 и Prnp o/o мышей подвергали воздействию аэрозолей, генерируемых 20% IBH, в течение 10 мин. Кривые Каплана-Мейера описывают процент выживаемости после определенных моментов времени после воздействия прионных аэрозолей (ось Y представляет процент живых мышей, ось X показывает время выживания в днях после инокуляции).Различные цвета и символы описывают различные экспериментальные группы. ( F ) Неравномерный график рассеяния времени выживания в зависимости от концентрации прионных аэрозолей, образующихся из IBH, с добавлением аппроксимации линейной регрессии (p = 0,0622). ( G ) График флуктуации времени выживания в зависимости от времени воздействия для мышей tg a 20 с добавлением линейной регрессии. Отрицательная корреляция между временем выживания и временем воздействия значима (p<0,001***). ( H ) Последовательные парафиновые срезы правого гиппокампа Prnp o/o , tg a 20 , мышей CD1 и C57BL/6, окрашенных HE (на предмет спонгиоза, глиоза, нейронов). SAF84 (отложения PrP Sc ), GFAP (астроглиоз) и Iba-1 (микроглия).Все животные подвергались воздействию аэрозолей, образующихся из 20% ИБГ, в течение 10 мин. Шкала баров: 100 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1001257.g001

tg a 20 мышей, подвергшихся воздействию аэрозольного 0,1% ИБГ, за период наблюдения не развился клинический скрепи (n = 4; эксперимент прекращен после 300 dpi), но обнаруживал PrP Sc головного мозга, указывающий на субклиническую прионовую инфекцию (рис. 1А и 2А). Напротив, у контрольных мышей tg a 20 (n = 4), подвергшихся воздействию HBH в виде аэрозоля, не развилось какое-либо распознаваемое заболевание даже при выдержке в течение ≥300 dpi, и в их мозге не было выявлено PrP Sc в гистоблотах и ​​вестерн-блотах. блоты (данные не показаны).

Рис. 2. Отложение PrP Sc в головном мозге мышей, инфицированных прионными аэрозолями, и профилирование мышей NSE-PrP .

( A ) Вестерн-блот анализ гомогенатов головного мозга (10%) терминальных или субклинических tg a 20 мышей, подвергшихся воздействию аэрозолей 20% или 0,1% IBH в течение 10 мин. PK+ или -: с расщеплением протеиназой К или без него; кДа: килодальтон. ( B–C ): вестерн-блот-анализ гомогенатов головного мозга мышей tg a 20 ( B ) или мышей CD1 ( C ), подвергшихся воздействию аэрозолей прионов из 20% IBH.( D ) Гистоблот-анализ головного мозга мышей, подвергшихся воздействию аэрозолей прионов. В мозге мышей tg a 20 , зараженных аэрозольным 10% (средняя панель) или 20% (правая панель) IBH, были обнаружены отложения PrP Sc в коре и среднем мозге. Поскольку в мозге мыши Prnp o/o сигнала не было (левая панель), мы делаем вывод, что сигнал на средней и правой панелях представляет собой локальную репликацию прионов. ( E ) Анализ степени тяжести гистопатологического поражения 5 областей головного мозга, изображенных в виде радарных диаграмм [51] (астроглиоз, губчатое изменение и отложение PrP Sc ), полученный из tg a 20 , CD1, C57BL/6 и 129SvxC57 /6 мышей, подвергшихся воздействию прионных аэрозолей.Цифры соответствуют следующим отделам мозга: (1) гиппокамп, (2) мозжечок, (3) обонятельная луковица, (4) лобное белое вещество, (5) височное белое вещество. ( F ) Оценка тяжести гистопатологического поражения 5 областей головного мозга, показанная в виде радарного блоттинга (астроглиоз, губчатое изменение и отложение PrP Sc ) в.к. прион инокулировали мкг a 20 , мышей CD1, C57BL/6 и 129SvxC57BL/6. 1 – гиппокамп, 2 – мозжечок, 3 – обонятельная луковица, 4 – белое вещество лобной области, 5 – белое вещество височной области.( G ) Кривая выживаемости и ( H ) оценки тяжести поражения мышей NSE-PrP , подвергшихся воздействию 20% аэрозольного IBH в течение 10 мин. ( I ) Гистологическая и иммуногистохимическая характеристика пораженного скрепи гиппокампа мышей NSE-PrP после воздействия аэрозольного 20% IBH. Обозначения пятен, как на рис. 1H. Масштабная линейка: 100 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1001257.g002

В приведенных выше экспериментах и ​​во всех экспериментах, описанных в оставшейся части этого исследования, все экспрессирующие PrP ( tg a 20 и WT ) мышей, у которых диагностировали неизлечимую болезнь скрепи, тестировали вестерн-блоттингом и гистологией: все они неизменно содержали PrP Sc в головном мозге (рис.2) и отображать все типичные гистопатологические признаки скрепи, включая спонгиоз, отложение PrP и астроглиоз (рис. 1H).

Корреляция времени воздействия прионных аэрозолей и инкубационного периода

Затем мы попытались определить минимальное время воздействия, при котором прионы могут передаваться через аэрозоли (рис. 1В, табл. 1). tg a 20 мышей подвергали воздействию аэрозольного ИБГ (20%) в течение различной продолжительности (1, 5 или 10 мин) в двух независимых экспериментах.Неожиданно было обнаружено, что времени воздействия всего 1 мин достаточно, чтобы вызвать 100% частоту приступов скрепи. Более длительное воздействие аэрозолей, содержащих прион, сильно коррелирует с укорочением инкубационного периода (рис. 1B и G, таблица 1, таблица S1A и B).

Чтобы проверить универсальность приведенных выше результатов, мы исследовали, могут ли аэрозоли передавать прионы различным линиям мышей (CD1, C57BL/6; 129SvxC57BL/6), экспрессирующим уровни дикого типа (wt) PrP C . Мышей CD1 подвергали воздействию аэрозольного 20% IBH в двух независимых экспериментах (фиг.1С, табл. 1). После 5 или 10-минутного воздействия все мыши CD1 умерли от скрепи, тогда как более короткое воздействие (1 минута) привело к степени атаки 0–50% [1-минутное воздействие (первый эксперимент): скрепи у мышей 0/3; экспозиция 1 мин (второй эксперимент): 2/4 мышей умерли от скрепи при 202±0 dpi; 5 мин (первый опыт): n = 4, частота атак 100%, 202±12 dpi; 5 мин (второй опыт): n = 3, частота атак 100%, 202±0 dpi; 10 мин (первый эксперимент): n = 4, частота атак 100%, 202±0 dpi; 10 мин (второй опыт): n = 4, частота атак 100%, 206±16 dpi].У мышей CD1, подвергшихся воздействию аэрозолей, содержащих прион, в течение более длительных интервалов, мы обнаружили тенденцию к сокращению времени инкубации, которая не достигла статистической значимости (таблицы S1A и S1B).

Мы также исследовали, будут ли мыши C57BL/6 или 129SvxC57BL/6 погибать от скрепи при воздействии прионных аэрозолей (рис. 1D и E, таблица 1). 10-минутная экспозиция с 20% IBH привела к частоте атак 100% (C57BL/6: 10 мин: n = 4; 185±11 dpi; 129SvxC57BL/6: n = 5; 10 мин: 182±15 dpi ). Контрольные мыши Prnp o/o (фон 129SvxC57BL/6; n = 3) были устойчивы к аэрозольным прионам (20%, 10 мин), как и ожидалось (рис.1Е и Н, таблица 1).

Время инкубации и скорость атаки зависят от уровня экспрессии PrP

C

Когда tg a 20 мышей подвергали контрольному заражению в течение 10 мин, вариации концентрации аэрозольного ИБГ оказывали незначительное влияние на время выживания ( p  = 0,062; рис. 1F), тогда как вариации продолжительности воздействия из tg a 20 мышей значительно повлияли на продолжительность их жизни ( p <0,001; рис.1Г). Кроме того, tg a 20 мышей, которые экспрессируют в 6-9 раз больше PrP C в центральной нервной системе (ЦНС), чем мыши дикого типа [46], [47], [48], значительно раньше погибали от скрепи при воздействие прионного аэрозоля в течение 10 мин (20%) ( мкг a 20 мышей: 134±4 dpi; мышей CD1: 202±12 dpi, p <0,0001; мышей C57BL/6: 185±11 dpi, p  = 0,003; мыши 129SvxC57BL/6: 182±15 dpi, p  = 0,003; рис. 1B–E, рис. S1, таблицы S1A и S1C).Время инкубации было увеличено, а передача была менее эффективной у мышей CD1, чем у мышей tg a 20 после 1-минутного воздействия прионных аэрозолей (20%). Вариабельность времени инкубации между мышами CD1 была низкой (1 st против 2 nd эксперимента с 5-минутной экспозицией: p  = 0,62, 1 st против 2 nd эксперимента с 10-минутной экспозицией). : p  = 0,27 (рис. 1В, табл. 1). Это говорит о том, что 1-минутного воздействия прионных аэрозолей (20%) на мышей CD1 достаточно для поглощения ≤1LD50 инфекционных единиц.Это открытие подчеркивает важность уровней экспрессии PrP C не только для времени инкубации, но также и для восприимчивости к инфекции и нейроинвазии при воздействии аэрозолей. Гистоблот-анализ подтвердил отложение PrP Sc в мозгу мышей tg a 20 , подвергавшихся воздействию аэрозолей прионов, полученных из 10% или 20% IBH, тогда как PrP Sc не был обнаружен в мозге Prnp 6 o мышей, подвергшихся воздействию аэрозолей прионов (рис. 2D).

Затем мы провели полуколичественный анализ гистопатологических поражений ЦНС. Следующие области мозга оценивались в соответствии со стандартизированной оценкой тяжести (астроглиоз, губчатые изменения и отложение PrP Sc ; [49]): гиппокамп, мозжечок, обонятельная луковица, лобное белое вещество и височное белое вещество. Оценки сравнивали с таковыми у мышей, инокулированных внутрикожно. с RML (рис. 2E и F). Профили поражения неизлечимо больных скрепи мышей ( tg a 20 , CD1, C57BL/6 и 129SvxC57BL/6), инфицированных i.в. или через аэрозоли были одинаковыми независимо от генетического фона или уровней экспрессии PrP C (рис. 2E и F), при этом CD1 и 129SvxC57BL/6 гиппокампа и мозжечка демонстрировали только легкие гистологические и иммуногистохимические признаки скрепи независимо от пути инокуляции.

Мы попытались проследить PrP Sc в носоглотке, полости носа или различных отделах головного мозга сразу после заражения прионным аэрозолем (через 1–6 часов после воздействия) и в различные моменты времени после интраназальных инокуляций (6, 12, 24, 72, 144 часа, 140 dpi и окончательно) с использованием различных методов, включая вестерн-блоттинг, гистоблот и анализ неправильной укладки белков.Однако ни один из этих анализов не обнаружил PrP Sc вскоре после воздействия прионного аэрозоля (6–72 часа после воздействия прионного аэрозоля), тогда как при 140 dpi или на терминальной стадии PrP Sc был обнаружен всеми этими методами (рис. S2; данные не показаны).

Экспрессия PrP

C на нейронах обеспечивает нейроинвазию прионов при заражении прионными аэрозолями

Затем мы исследовали, будет ли экспрессия PrP C в нейронах достаточной для индукции скрепи после воздействия прионов через аэрозоли. Трансгенные мыши NSE-PrP селективно экспрессируют PrP C в нейронах, а при размножении на фоне Prnp o/o ( Prnp o/o / ) проявляют Cr-Prestricted

9/ Prnp o/o / уровни экспрессии сходны с мышами дикого типа [50].

Prnp o/o / NSE-PrP (далее обозначаемый как NSE-PrP ) мышей подвергали воздействию аэрозолей приона (20% гомогенат; 10 мин). Все мышей NSE-PrP умерли от терминального скрепи (216±8 dpi; n = 4; рис.1E, 2G, таблица 1), хотя время инкубации было значительно больше, чем у мышей дикого типа 129SvxC57BL/6 (180 ± 15 dpi; n = 5; p  = 0,004). Гистология и иммуногистохимия подтвердили скрепи в мозге NSE-PrP (рис. 2H и I). Гистопатологический анализ тяжести поражения (см. выше) выявил профиль поражения, примерно аналогичный таковому у контрольных мышей 129SvxC57BL/6 (рис. 2E, H). Более тяжелые поражения наблюдались в мозжечке NSE-PrP , тогда как обонятельные луковицы были менее поражены.

ПЦР-анализ в реальном времени выявил 2–4 копии трансгена на аллель Prnp у мышей Prnp o/o /NSE-PrP .

Детальный количественный анализ уровней экспрессии PrP C в различных участках ЦНС был выполнен путем сравнения сигналов, полученных при блотинге различных количеств белка из тканей NSE-PrP , wt и tg a 20 (фиг. С3). Значение 100 было произвольно присвоено экспрессии PrP C в тканях дикого типа; обонятельный эпителий мышей tg a 20 и NSE-PrP экспрессировал ≥350 и ∼30 соответственно (фиг.С3А). В обонятельных луковицах мыши tg a 20 и NSE-PrP экспрессировали ≥150 и 30 соответственно (рис. S3B). В полушариях головного мозга мышей tg a 20 и NSE-PrP экспрессия >250 и >150 соответственно (рис. S3C). Таким образом, мыши линии NSE-PrP экспрессировали несколько больше PrP C , чем мыши дикого типа, в полушариях головного мозга, но несколько меньше в обонятельных луковицах и обонятельном эпителии.

Аэрозольная прионная инфекция не зависит от иммунной системы

Во многих парадигмах внемозговой прионной инфекции эффективная нейроинвазия зависит от анатомической и физиологической целостности нескольких компонентов иммунной системы [40], [42], [43], [44].Чтобы определить, верно ли это для аэрозольных заражений прионами, мы подвергали линии мышей с иммунодефицитом воздействию прионных аэрозолей. Эта серия экспериментов включала мышей JH -/- , у которых избирательно отсутствуют В-клетки, и мышей γ C Rag2 -/- , лишенных зрелых В-, Т- и NK-клеток. (рис. 3А). При воздействии прионного аэрозоля (20 % IBH; время воздействия 10 мин) обе мыши JH -/- и γ C Rag2 -/- умерли от скрепи со 100-процентной частотой поражения ( JH

).

-/- : n = 6, 181±21 dpi, γ C Rag2 -/- : n = 11, 185±41 dpi,
 =.
5). Время инкубации существенно не отличалось от времени инкубации мышей дикого типа C57BL/6, подвергшихся воздействию аэрозолей приона (мыши JH -/- : p  = 0,9; γ мыши C Rag2 -/- 9: р  = 0,7).

Рисунок 3. Передача прионов через аэрозоли у мышей с ослабленным иммунитетом.

Кривые выживаемости, анализ степени тяжести поражения (радиолокационные диаграммы) и репрезентативные гистопатологические микрофотографии мышей с генетически или фармакологически нарушенными компонентами иммунной системы ( JH -/- , γ C Rag2 -/ – A ), мыши 129Sv, получавшие LTβR-Ig или muIgG ( B ), и LT β R -/- и CD40 -/909 3 9028 902 мыши ).Всех мышей в течение 10 мин подвергали воздействию аэрозоля 20% IBH. Код окраски: HE (спонгиоз, глиоз, потеря нейронов), SAF84 (отложения PrP Sc ), GFAP (астроглиоз) и Iba-1 (микроглиальная активация), как на рис. 1H. Шкала баров: 100 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1001257.g003

Гистологический и иммуногистохимический анализ подтвердил скрепи у всех клинически диагностированных мышей. Анализ оценки тяжести поражения (рис. 3A и 3E) показал, что у мышей JH -/- и γ C Rag2 -/- были более низкие оценки профиля в мозжечке и более высокие оценки в гиппокампе и лобном белом веществе. чем у мышей C57BL/6.Несколько более высокие показатели в височных областях белого вещества мозга и таламусе были обнаружены у мышей JH -/- и γ C Rag2 /-/- , тогда как у мышей γ C -/- Rag2 − мышей показали более низкие показатели в обонятельных луковицах. В соответствии с несколькими предыдущими сообщениями, γ C Rag2 -/- мышей (n = 4) не умерли от скрепи после внутрибрюшинного введения. инокуляция прионов (100 мкл RML6 0,1% 6 log LD50) даже при воздействии титра прионов, который был вдвое выше, чем при интраназальных инокуляциях (данные не показаны).

В зависимости от времени воздействия и концентрации IBH у мышей tg a 20 в селезенке появились отложения PrP Sc . Напротив, ни одна из мышей JH -/- , LTβR -/- и γ C Rag2 -/- , больных скрепи, не обнаруживала PrP Sc в селезенке на его Вестерн-блоте и/или (рис. S4A-D), несмотря на большое количество PrP Sc в головном мозге.

Аэрозольная инфекция не зависит от фолликулярных дендритных клеток

Фолликулярные дендритные клетки (ФДК) необходимы для репликации прионов во вторичных лимфоидных органах и для нейроинвазии после i.п. или пероральная прионовая стимуляция [42], [44], [51]. Лечение слитым белком лимфотоксин бета-рецептор-Ig (LTβR-Ig) у мышей C57BL/6 вызывает дедифференцировку зрелых FDC, что приводит к снижению периферической репликации прионов и нейроинвазии при экстраневральной (например, внутрибрюшинной или пероральной) инокуляции прионов [52], [53]. Поэтому мы исследовали, требуются ли FDC для репликации прионов после заражения прионными аэрозолями. Мышам C57BL/6 вводили LTβR-Ig или неспецифический объединенный мышиный IgG (muIgG) до и после заражения прионами (-7, 0 и +7 дней) (фиг.3Б). Эффекты лечения LTβR-Ig контролировали с помощью окрашивания Mfg-E8 + /FDC-M1 + сетей зрелых FDC в лимфоидной ткани. Этот анализ выявил полную потерю сетей Mfg-E8 + /FDC-M1 + в день воздействия приона и на 14 dpi (данные не показаны).

Лечение LTβR-Ig и дедифференцировка FDC не изменили время инкубации при аэрозольной прионной инфекции (LTβR-Ig: n = 3, частота поражений 100%, 184±0 dpi; muIgG: n = 3, частота поражений 100%, 184± 0 точек на дюйм) (рис.3В, таблица 2). Диагноз терминальной скрепи был подтвержден гистологическим и иммуногистохимическим анализами у всех клинически пораженных мышей (рис. 3В; данные не показаны). Оценка тяжести гистопатологического поражения показала, что мыши C57BL/6, получавшие LTβR-Ig, демонстрировали более высокие баллы во всех исследованных областях, чем мыши C57BL/6, не получавшие лечения, при заражении прионными аэрозолями (20% IBH; 10 мин) (рис. 2E и 3B). Мы обнаружили несколько менее тяжелые показатели в обонятельных луковицах мышей C57BL/6, получавших muIgG, чем у нелеченых мышей C57BL/6 при заражении прионными аэрозолями (рис.2E и 3B), и немного более высокий балл в височном белом веществе (воздействие 20% аэрозоля в течение 10 мин; рис. 2E и 3B).

Аэрозольная инфекция прионами мышей, лишенных LTβR или CD40L

Передача сигналов

LTβR необходима для правильного развития вторичных лимфоидных органов и для поддержания лимфоидной микроархитектуры, и недавно было показано, что она играет важную роль в репликации прионов в эктопических лимфоидных фолликулах и гранулемах [40], [41], [44]. Чтобы исследовать роль этого пути в аэрогенных прионовых инфекциях, мышей LTβR -/- подверглись воздействию прионовых аэрозолей (20% IBH; время воздействия 10 минут).Все мыши LTβR -/- умерли от скрепи ( LTβR -/- : n = 4, 272±0 dpi) и обнаружили отложения PrP в головном мозге (рис. 3C). Оценка гистологической тяжести у мышей, подвергшихся воздействию аэрозоля, выявила более высокие показатели в гиппокампе LTβR -/- и более низкие показатели в мозжечке, обонятельных луковицах, лобных и височных отделах белого вещества, чем в контрольной группе C57BL/6 (воздействие: 20%; 10 мин; рис. 2Е и 3С).

Затем мы исследовали роль рецептора CD40 в прионной аэрозольной инфекции.У мышей CD40 -/- не развиваются зародышевые центры и В-клеточный ответ памяти, однако у мышей CD40L -/- время инкубации после внутрибрюшинного введения остается неизменным. прионовая провокация [54]. Подобно другим исследованным моделям мышей с ослабленным иммунитетом, у мышей CD40 -/- развилась терминальная скрепи при заражении прионными аэрозолями с частотой поражения 100% (n = 3, 276±50 dpi). Анализ тяжести поражения мышей CD40 -/- выявил несколько более высокие баллы в мозжечке и височном белом веществе, чем у мышей C57BL/6 (рис.2Е и 3С). Следовательно, передача сигналов LTβR и CD40 необязательна при аэрозольной прионной инфекции.

Компоненты системы комплемента необязательны при аэрозольной прионной инфекции

Определенные компоненты системы комплемента (например, C3; C1q a) играют важную роль в раннем поглощении прионов, периферической репликации прионов и нейроинвазии после периферической прионной провокации [43], [55], [56]. Мы проверили, верно ли это и для воздействия прионных аэрозолей. Мышей, лишенных обоих компонентов комплемента С3 и С4 ( C3C4 -/- ), подвергали воздействию 20% аэрозольного IBH в течение 10 минут.Все C3C4 -/- мышей умерли от скрепи (n = 3, 382±33 dpi; рис. 4A). Гистопатологическая оценка всех мышей, пораженных скрепи, выявила астроглиоз, губчатые изменения и отложение PrP в ЦНС (рис. 4А).

Рис. 4. Передача прионов через аэрозоли у мышей с дефицитом комплемента и у новорожденных мышей.

( A ) C3C4 -/- мышей и ( B ) новорожденных tg a 20 и мышей CD1 подвергали воздействию аэрозоля 20% IB в течение 10 минут.Кривые выживаемости (правые панели) , а также гистологическая и иммуногистохимическая характеристика гиппокампа показывают, что у всех подвергшихся воздействию приона мышей скрепи развился эффективно. Шкала баров: 100 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1001257.g004

Отсутствие защиты новорожденных мышей от прионных аэрозолей

Приведенные выше данные свидетельствуют в пользу прямой нейроинвазии через экспрессирующие PrP C нейроны при введении аэрозоля.Однако возможным альтернативным механизмом передачи может быть глазной путь, а именно через роговицу, сетчатку и зрительный нерв [57], [58]. Чтобы проверить эту возможность, новорожденных (в возрасте <24 часов) мышей tg a 20 и мышей CD1, веки которых были еще закрыты, в течение 10 минут подвергали воздействию прионных аэрозолей, генерируемых 20% IBH. Все мыши умерли от скрепи и показали отложения PrP в головном мозге (мыши мкг a 20 : n = 3, 173±23 dpi; мыши CD1: n = 3, 211±0 dpi) (рис.4Б). Новорожденные мыши tg a 20 умирали от скрепи немного позже ( p  = 0,0043), чем взрослые мыши tg a 20 , тогда как между новорожденными и взрослыми мышами CD1, подвергавшимися воздействию аэроприона в течение 10 мин, различий не наблюдалось. получен из 20% IBH ( p  = 0,392).

Мозг всех животных содержал материал, устойчивый к ПК, по оценке вестерн-блоттинга (данные не показаны). Кроме того, у необработанных однопометников или других контрольных особей, которых выращивали или содержали вместе с обработанными аэрозолем мышами сразу после воздействия аэрозолей, не было обнаружено ни признаков скрепи, ни PrP Sc в головном мозге даже после 482 dpi.Это предполагает, что передача прионов была следствием прямого воздействия на ЦНС аэрозолей прионов, а не результатом передачи другими путями, такими как проглатывание меха при уходе за шерстью или воздействие загрязненных прионами фекалий или мочи.

Отсутствие PrP

Sc во вторичных лимфоидных органах мышей с иммунодефицитом, больных скрепи после заражения прионными аэрозолями

Далее мы исследовали дополнительных мышей на наличие PrP Sc во вторичных лимфоидных органах при воздействии прионных аэрозолей.В терминальной стадии заболевания в селезенке, бронхиальных лимфатических узлах (млн) и мезентериальных лимфатических узлах (млн) искали резистентный к ПК материал. C57BL/6, 129SvxC57BL/6, обработанные muIgG мыши C57BL/6, новорожденные tg a 20 мыши, а также новорожденные мыши CD1 содержали PrP Sc в LRS, тогда как LTβR -/- мышей и C57BL/ У 6 мышей, получавших LTβR-Ig, отложения PrP Sc в селезенке отсутствовали (рис. S4A–F; таблица 3).

Эффективность интраназального введения прионов зависит от уровня экспрессии PrP

C

Чтобы отделить аэрозольно-опосредованное воздействие от неаэрозольного воздействия прионов, мы непосредственно применяли прионную суспензию (RML 6.0, 0,1%, 40 мкл, что соответствует 4×10 5 LD 50 прионов скрепи) на слизистую оболочку носа различных линий мышей (рис. S5). Поскольку мыши дышат исключительно через ноздри [59], [60], мы пришли к выводу, что эта процедура будет имитировать аэрозольную передачу с достаточной точностью, хотя механизмы поглощения прионов могут различаться при аэрозольном и интраназальном введении [11].

tg a 20 (n = 10), 129SvxC57BL/6 (n = 5), C57BL/6 (n = 8) и Prnp o/o мышей) интраназально прионы (рис.С5). Чтобы проверить возможность того, что сама процедура прививки может повлиять на продолжительность жизни мышей, мышам C57BL/6 (n = 4) интраназально прививали гомогенат здорового мозга (HBH) для контроля (рис. S5E). Ни у одного из животных, которым был привит HBH, продолжительность жизни не сократилась, и у них не развились какие-либо клинические признаки заболевания – даже при выдерживании в течение ≥500 dpi. Напротив, после интраназальной инокуляции приона все мыши C57BL/6, 129SvxC57BL/6 и tg a 20 умерли от скрепи со 100% атакой (рис.S5A–C), тогда как мыши Prnp o/o были устойчивы к интраназальным прионам (рис. S5D). После интраназальной инокуляции мыши tg a 20 (n = 10, 160±28 dpi) показали более короткое время инкубации (рис. S5C), чем 129SvxC57BL/6 (n = 5, 217±20 dpi) или C57BL/6. мыши (n = 8, 266±33 dpi; рис. S5A и S5B). Кроме того, гистологический и иммуногистохимический анализы на спонгиоз, астроглиоз и характер отложения PrP подтвердили терминальную скрепи (рис. S5J). Гистопатологический анализ степени тяжести поражения выявил сходные профили поражений, обнаруженные после воздействия прионных аэрозолей (рис.С5К). Однако в обонятельной луковице мышей tg a 20 и 129SvxC57BL/6 оценка была ниже при интраназальном введении, чем при аэрозольной парадигме (рис. 2Е).

Наконец, мы проверили, будет ли передача прионов через интраназальный путь происходить за счет селективной экспрессии PrP C на нейронах. Для этого мы привили мышей NSE-PrP . Все интраназально зараженные мыши NSE-PrP (n = 6, 291±86 точек на дюйм) умерли от скрепи. Время инкубации до терминальной стадии заболевания существенно не отличалось от такового у контрольных мышей 129SvxC57BL/6 (n = 5, 217±20 dpi; p  = 0.0868).

Интраназальная передача приона при отсутствии функциональной иммунной системы

Затем мы стремились определить, какие компоненты (если таковые имеются) иммунной системы необходимы для нейроинвазии при интраназальном заражении прионами. Для ответа на этот вопрос мышам Rag1 -/- и γ C Rag2 -/- интраназально инокулировали прионы (посевной материал RML 6,0, 0,1%, 40 мкл, что эквивалентно 4×18 29 902 902). LD 50 прионы скрепи).Примечательно, что все интраназально инокулированные прионами мыши Rag1 -/- (n = 9, 203±6 dpi) (рис. 5A и H) и γ C Rag2 -/- мышей (n16= , 243 ± 24 dpi) (рис. 5D и G) погиб от скрепи, что свидетельствует о независимом от LRS механизме прионной нейроинвазии при интраназальном введении. Время инкубации у Rag1 -/- значительно отличалось от такового у контрольных мышей, зараженных интраназально (C57BL/6; частота атак 100%; n = 8, 266±33 dpi; p  = 0.0009), тогда как мыши γ C Rag2 -/- не отличались от таковых у контрольных мышей, зараженных интраназально (Balb/c: частота атак 100%, n = 6, 209±48 точек на дюйм, p  = 0,009). ) (рис. 5B и рис. 5D).

Рис. 5. Передача прионов при интраназальном введении.

( A ) Rag1 -/- мышей, интраназально инокулированных RML6 0,1%, ( B ) C57BL/6 мышей, которым интраназально инокулировали 3×10 8 5 LD ( C ) Rag1 -/- мышей в.к. Иницируется с 3 × 10 5 LD 50 , ( D ) γ C Rag2 C Rag2 – / – – MICE, интраназально инокулированные с 4 × 10 5 LD 50 или ( E ) Показаны мыши Balb/c, интраназально инокулированные 4×10 5 LD 50 прионов скрепи. Кривые выживания ( AD ) и соответствующие вестерн-блоты ( F-G ) свидетельствуют об эффективной нейроинвазии прионов.Гомогенаты мозга анализировали с (+) и без (-) предшествующей обработки протеиназой K (PK), как указано. Гомогенаты мозга, полученные от неизлечимо больных скрепи и здоровых мышей C57BL/6, служили в качестве положительного и отрицательного контроля (s: больные; h: здоровые) соответственно. Молекулярные массы (кДа) указаны слева от блотов. ( H и I ) Оценка тяжести гистопатологического поражения, описанная как радиолокационное пятно (астроглиоз, губчатое изменение и отложение PrP Sc ) в 5 областях мозга обеих линий мышей, подвергшихся воздействию прионных аэрозолей.Цифры соответствуют следующим отделам мозга: (1) гиппокамп, (2) мозжечок, (3) обонятельная луковица, (4) лобное белое вещество, (5) височное белое вещество.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1001257.g005

После интраназального введения приона PrP Sc присутствовал в ЦНС Rag1 -/- или γ C Rag 6 -/- мышей. Анализ WB подтвердил терминальную скрепи (рис. 5G и H). Гистопатологическая оценка тяжести поражения выявила отчетливый профиль поражения, характеризующийся высокой оценкой в ​​височном белом веществе и таламусе в случае Rag1 -/- мышей.В случае мышей γ C Rag2 -/- мозжечок, обонятельная луковица и лобное белое вещество показали более низкие оценки (рис. 5I и J). В отличие от ЦНС, селезенка пораженных животных не содержала PK-резистентного материала у неизлечимо больных мышей Rag1 -/- и γ C Rag2 -/- (рис. S6E).

В качестве контроля мышам Rag1 -/- , а также γ C Rag2 -/- интраназально инокулировали HBH, чтобы проверить возможность того, что интраназальная инокуляция сама по себе влияет на продолжительность их жизни.Ни одна из мышей, привитых HBH, не умерла спонтанно или не развилась скрепи до ≥300 точек на дюйм (n = 4 каждая; рис. S6A, C-D). Кроме того, у мышей Balb/c и мышей C57BL/6 (n = 4 каждая), интраназально инокулированных HBH (рис. S5E и S6D), не развивалось какое-либо заболевание при ≥300 dpi.

В качестве положительного контроля Rag1 -/- мышей подвергали внутрикожному инъецированию. инокулировали 3×10 5 LD 50 прионов скрепи. Это привело к терминальной стадии болезни скрепи примерно через 130 дней и частоте поражений 100% (n = 3, 131±8 dpi) (рис.5В, и данные не показаны).

В качестве дополнительных отрицательных контролей мышей Rag1 -/- и γ C Rag2 -/- инъецировали внутрибрюшинно. инокулировали прионами (100 мкл RML 0,1%, 1×10 6 LD 50 ). Хотя применялось больше инфекционных прионов (примерно в 2 раза больше) по сравнению с интраназальным путем, внутрибрюшинно. инокуляции прионов было недостаточно, чтобы вызвать скрепи у мышей Rag1 -/- и γ C Rag2 -/- (частота поражения: 0%, n = 4 для каждой группы, эксперимент прекращен после 400 ).

Значение системы комплемента для патогенеза прионов после интраназального заражения

Компонент комплемента C1q a участвует в облегчении связывания PrP Sc с рецепторами комплемента на FDC [56]. Соответственно, мыши C1q a -/- устойчивы к прионной инфекции при периферической инокуляции в низких дозах. CD21 -/- мыши лишены рецептора комплемента 1, имеют нормальную лимфоидную микроархитектонику и демонстрируют уменьшение размера зародышевого центра.Время инкубации у мышей CD21 -/- значительно увеличивается при периферической инокуляции прионов через внутрибрюшинное введение. маршрут [56].

Чтобы определить, участвует ли система комплемента в прионной инфекции через аэрозоли, мышам C1q a -/- и CD21 -/- интраназально вводили прионы. C1q a -/- мышей и CD21 -/- мышей умерли от скрепи с частотой поражения 100% ( C1q a -/- мышей: n =28 4, 6 8 4, ; CD21 -/- мышей: n = 10, 235±24 dpi) (фиг.6A-C), с мышами CD21 -/- , умершими от скрепи немного раньше по сравнению с мышами C1q a -/- . Однако время выживания существенно не отличалось от контрольных мышей C57BL/6 (n = 8, 266±33 dpi; C1q a -/- мышей: p  = 0,24; CD21 -/- мышей : p  = 0,05) (рис. S5A и S5B). Вестерн-блот анализ одной неизлечимо больной скрепи C1q мыши -/- выявил одну PrP Sc положительную селезенку (1/4) (фиг.S6F). У двух неизлечимо больных скрепи мышей CD21 -/- в селезенке была обнаружена резистентность к ПК (2/10) (рис. S6G). Эти результаты показывают, что компоненты комплемента C1qa и CD21 не являются существенными для размножения прионов при интраназальном введении.

Рис. 6. Интраназальная передача прионов у мышей с иммунодефицитом.

Всем мышам интраназально вводили 3×10 5 LD 50 прионов. ( A ) C1q a -/- мышей, которым интраназально инокулировали, и ( B ) CD21 -/- мышей, которым интраназально инокулировали.Кривые выживаемости иллюстрируют выживаемость после интраназального введения приона. Показаны соответствующие вестерн-блоты мышей C1qa -/- , интраназально инокулированных ( С, левая панель ), и мышей CD21 -/- , инокулированных интраназально ( С, правая панель ). Показаны кривые выживания мышей линии CXCR5 -/- , интраназально инокулированных ( D ). Соответствующие вестерн-блоты CXCR5 -/- мышей, интраназально инокулированных.Гомогенаты мозга анализировали с (+) и без (-) предшествующей обработки протеиназой K (PK), как указано. Органы управления и легенды как на рис. 5.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1001257.g006

Дефицит CXCR5 не сокращает время инкубации приона при интраназальной инфекции

CXCR5 контролирует расположение В-клеток в лимфоидных фолликулах, а FDC мышей с дефицитом CXCR5 находятся в непосредственной близости от нервных окончаний, что приводит к сокращению времени инкубации после i.п. инокуляция прионов [39], [61]. Здесь мы исследовали влияние дефицита CXCR5 на интраназальную инокуляцию прионов. CXCR5 -/- Мыши демонстрировали уровень атаки 100%, а время инкубации существенно не отличалось от такового у мышей C57BL/6 (n = 5, 313±91 dpi; p  = 0,32) (рис. 6D). ). У 3 из 5 неизлечимо больных скрейпи мышей CXCR5 -/- в селезенке был обнаружен устойчивый к ПК материал (3/5), что было обнаружено с помощью вестерн-блоттинга (рис. S6H).

Прионная инфекция не зависит от передачи сигналов LTβR и TNFR1

Фармакологическое ингибирование передачи сигналов LTβR сильно снижает периферическую репликацию прионов и снижает или предотвращает нейроинвазию прионов при внутрибрюшинном введении. прионовая провокация [42], [44], [53]. Чтобы определить, повлияет ли ингибирование передачи сигналов LTβR на передачу приона через носовую полость, мы вводили мышам C57BL/6 100 мкг LTβR-Ig, а для контроля — 100 мкг muIgG/мышь/неделю до и после прионной стимуляции (–7 дней, 0 дней, +7 дней; 14 дней).Затем мышам, получавшим LTβR-Ig, интраназально вводили прионы. 100% мышей, зараженных интраназально, погибли из-за терминальной скрепи (мыши C57BL/6, получавшие LTβR-Ig: n = 8, 476±200 dpi; рис. 7A). Мыши, получавшие MuIgG, служили в качестве контроля и показали незначительное сокращение времени инкубации (частота атак: 100%, n = 9, 246±29 dpi) (рис. 7B и C; C57BL/6 LTβR-Ig обработанные по сравнению с обработанными muIgG мышами: p  = 0,014; C57BL/6 без лечения по сравнению с LTβR-Ig обработанными мышами C57BL/6: p  = 0,021; C57BL/6 без лечения по сравнению с C57BL/6 без лечения.Мыши, получавшие C57BL/6 muIgG: p  = 0,22).

Рис. 7. Интраназальная передача прионов не зависит от передачи сигналов лимфотоксина.

Мышей C57BL/6, получавших LTβR-Ig ( A ) или контрольный muIgG ( B ), и мышей, лишенных различных компонентов системы LT/TNF ( D–F , как указано), интраназально инокулировали 4×10 5 LD 50 Прионы скрепи. Кривые выживания ( A, B, D, E и G ) и соответствующие вестерн-блоты ( C, F и H ) указывают на эффективную прионную инфекцию и нейроинвазию.Об одном животном, которое умерло рано после интраназальной инокуляции (40 dpi), сообщается как об интеркуррентной смерти (i.d.) по причинам, отличным от скрепи. Гомогенаты мозга анализировали с (+) и без (-) предшествующей обработки протеиназой K (PK), как указано. Используемые элементы управления и легенды такие же, как на рис. 1H.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1001257.g007

Мы дополнительно оспаривали LTβR – / – , TNFR1 и – / – и

LTα

– / – MICENASALAS с прионами RML (рис.7D–H). В этих условиях все LTβR – / – , TNFR1 – / – и LTα
– / – MICE, разработанные Terminal Scrapie ( LTβR – / – Мышей: N = 6, 291 ±52 dpi; TNFR1 -/- мышей: n = 3, 213±1 dpi; LTα -/- мышей: n = 6, 251±20 dpi) (рис. 7D-H). Терминальная скрепи была подтверждена иммуногистохимией, гистоблоттингом и анализом WB (фиг. 7F и H, данные не показаны). Сексинес интраназально инокулированных LTβR – / – и – / – и TNFR1 и – / –
Мыши отображаются без устойкого PK материала ( LTβR – / – MICE: 0/6; TNFR1 – / – мыши: 0/3).У LTα -/- мышей 1 из 6 селезенки содержала PrP Sc , в то время как селезеночные PrP Sc отложения резистентного к ПК материала были в изобилии обнаружены у неизлечимо больных скрепи tg a 2 2 мышей tg a 20 мышей: 2/10) (рис. S6I-L).

Обсуждение

Хотя воздушная передача является обычной для многих бактерий и вирусов, она не была тщательно исследована для прионных аэрозолей [11], [12], [29], [30], [31], [32], [33 ], [34], [62] и прионы обычно не считаются переносимыми по воздуху патогенами.Тем не менее, обонятельные нервы обсуждались как возможное место проникновения прионов [11], и действительно, контактно-опосредованное воздействие прионов на ноздри может эффективно заражать различные виды. Поэтому мы решили исследовать возможную опасность прионной инфекции, возникающей в результате воздействия прионных аэрозолей. Наши результаты показывают, что содержащие прион аэрозоли гомогенизируют головной мозг, что аэрозоли являются эффективными переносчиками прионов.

Время инкубации и скорость атаки после воздействия прионных аэрозолей зависели в первую очередь от времени воздействия, уровня экспрессии PrP C у реципиентов и, в меньшей степени, от титра прионов материалов, используемых для создания прионных аэрозолей в стандартизированной ингаляционной камере. .Первостепенная роль времени воздействия предполагает, что скорость трансэпителиального проникновения прионов через дыхательные пути может быть лимитирующей, даже когда прионы предлагаются в относительно низких концентрациях. И наоборот, общая способность поглощения прионов дыхательной системой никогда не ограничивала скорость, потому что время инкубации скрепи прогрессивно уменьшалось с более высокими концентрациями и более длительным временем воздействия, а также потому, что мы не смогли установить плато ответа. Последнее явление может быть объяснено большой альвеолярной поверхностью, потенциально доступной для поглощения прионов.

Поскольку аэрозольная инфекция возникает у мышей дикого типа с разным генетическим фоном (C57BL/6; CD1; 129SvxC57BL/6), она может представлять собой универсальное явление, не связанное с генетическими особенностями какой-либо конкретной линии мышей (на рис. S7 представлена ​​репрезентативная панель гистологических особенности у мышей CD1). Однако у мышей CD1 скорость прогрессирования клинического заболевания не коррелировала со временем воздействия при данной концентрации ИБГ, используемого для создания аэрозолей прионов, что указывает на существование генетических факторов, модулирующих насыщение аэрогенного поступления прионов.

Для прохождения инфекции из брюшины в мозг требуется некроветворный канал, который экспрессирует PrP C [63]. Поэтому мы стремились определить, потребуется ли такой канал для передачи инфекционности от аэрозолей к мозгу реципиентов. Используя трансгенных мышей NSE-PrP , мы обнаружили, что нейрон-селективной экспрессии PrP C достаточно, чтобы сделать мышей восприимчивыми к прионной инфекции при аэрозолях и интраназальном введении.Следовательно, экспрессия PrP C в ненервных тканях не требуется для аэрозольной или интраназальной нейроинвазии.

После периферического воздействия многие возбудители ТГЭ накапливаются и размножаются в лимфоидных тканях хозяина, включая селезенку, лимфатические узлы, пейеровы бляшки и миндалины [59], [64], [65], [66], [67], [68]. ], [69] при В-клеточном и лимфотоксин-зависимом процессе [70], [71]. После периферической репликации в LRS прионы получают доступ к ЦНС преимущественно через периферические нервы [23]; иннервация вторичных лимфоидных органов и расстояние между ФДК и окончаниями селезеночного нерва являются лимитирующим шагом для нейроинвазии [38][39].

В отличие от вышеизложенного, аэрозольное и интраназальное воздействие приводило к прионной инфекции в отсутствие B-, T-, NK-клеток и зрелых FDC. Хотя у некоторых мышей с иммунодефицитом (например, LTβR -/- и C3C4 -/- ) и после лечения LTβR-Ig была обнаружена тенденция к небольшой задержке времени инкубации, эти различия не были статистически значимыми, и все другие иммунодефицитные ( JH -/- , Rag1 -/- и γ C Rag2 -/- ), а также дефицит комплемента (например,г. Мыши C3C4 и CD21) были восприимчивы к аэрозольному и интраназальному заражению прионами так же, как и контрольные мыши. Мы пришли к выводу, что передача в ЦНС при аэрозольной инокуляции прионов не требует ни функциональной адаптивной иммунной системы, ни микроанатомически интактных герминативных центров со зрелыми ФДК. Кроме того, вмешательство в передачу сигналов LT, будь то лечение LTβR-Ig или удаление LTβR, указывает на то, что анатомическая и функциональная неповрежденность лимфоидных органов необязательна для прионной нейроинвазии, репликации прионов в головном мозге и клинической скрепи.

После генетического удаления основных клеточных компонентов LRS (например, путем скрещивания с мышами, лишенными Т-, В-клеток или NK-клеток, у мышей JH -/- или γ C Rag2 -/- ) а также генетическое (LTα -/- ; LTβR -/- ) или фармакологическое (LTβR-Ig) истощение фолликулярных дендритных клеток – основной клетки, ответственной за репликацию прионов во вторичных лимфоидных органах – не изменили течения при заражении прионными аэрозолями, мы заключаем, что приведенные выше данные свидетельствуют о том, что LRS необязателен при заражении прионами аэрогенным путем.Поэтому мы предполагаем, что переносимые по воздуху прионы следуют пути прямой нейроинвазии прионов вдоль обонятельных нейронов, которые распространяются на поверхность обонятельного эпителия. Инфекционность новорожденных мышей поддерживает эту гипотезу, поскольку у этих мышей не было полностью зрелой иммунной системы во время воздействия прионов.

Наши результаты противоречат предыдущим исследованиям [12], утверждавшим роль иммунной системы в нейроинвазии при интраназальной прионной инфекции, но согласуются с недавней работой [11], показывающей, что нейроинвазия прионов с языка и носовой полости может происходить в отсутствие прион-инфицированный LRS.Также показана передача CWD «цервидизированным» трансгенным мышам через аэрозоли и при интраназальном введении [45].

У обеих мышей LTβR -/- и LTα -/- отсутствуют пейеровы бляшки и лимфатические узлы, а также интактный NALT, что может влиять на способность к репликации прионов [11], [12], [29], [30], [31], [32], [33], [34], [63]. Кроме того, у этих мышей наблюдается хроническая интерстициальная пневмония. В соответствии с ролью передачи сигналов LTβR при периферической прионной инфекции, эти мыши не реплицируют прионы, введенные внутрибрюшинно.С другой стороны, у мышей TNFR1 -/- отсутствуют пейеровы бляшки, наблюдается аберрантная микроархитектоника селезенки, аномальный NALT, но есть интактные лимфатические узлы, в которых репликация прионов может происходить эффективно [72]. Однако эффективность репликации прионов в селезенке почти полностью исчезает [73], и мыши TNFR1 -/- умирают из-за скрепи после длительного инкубационного периода при периферическом заражении прионами.

В настоящем исследовании все мыши LTα -/- умерли от скрепи при интраназальной инфекции, тогда как некоторые мыши LTα -/- заразились прионами после воздействия на полость носа в предыдущем исследовании [11].Потребность в LRS при интраназальной прионной инфекции может зависеть от конкретного тестируемого прионного штамма и от размера вводимого инокулята. При наличии в достаточно высоких титрах прионы могут напрямую проникать в нервную систему через слизистую оболочку носа и окончания обонятельных нервов (рис. 8). Однако в предельных дозах инфекция воздушным прионом может быть усилена LRS-зависимой стадией преамплификации (рис. 8), например. в бронхиальных лимфатических узлах (BLN), носу, лимфоидной ткани, связанной с кишечником (NALT; GALT), или селезенке.В этом исследовании размер частиц, генерируемых распылителем, обеспечивал заполнение аэрозолем всего респираторного тракта, так что аэрозольный гомогенат мозга, содержащий прион, достигал альвеолярной поверхности легких. Там прионы могут также колонизировать лимфоидные ткани, связанные с дыхательными путями, и получить доступ к ЦНС (рис. 8).

Рис. 8. Модель возможных путей аэрогенной передачи прионов.

(слева) Аэрозоли прионов, попадая в носовую полость (1), могут мигрировать непосредственно через носовой эпителий к окончаниям обонятельных нервов (2).Впоследствии прионы достигают нейронов обонятельных луковиц и колонизируют лимбическую систему и другие области мозга (3). Прионы могут попасть в глаза, откуда они могут попасть через зрительную систему (например, зрительные нервы) в ЦНС. О: обонятельная система; V: зрительная система. В качестве альтернативы (справа) прионов могут поглощаться иммунными клетками, находящимися в (1) носовой полости, легких или (2) желудочно-кишечном тракте, откуда они могут переноситься в компоненты лимфоретикулярной системы (ЛРС), такие как бронхиальные лимфатические узлы (BALT), ассоциированная с носом лимфоидная ткань (NALT), желудочно-кишечная лимфоидная ткань (GALT), мезентериальные лимфатические узлы или селезенка для дальнейшей амплификации.Впоследствии прионы перемещаются к окончаниям периферических нервов (ПНС), откуда проникают в центральную нервную систему (ЦНС). СК: спинной мозг. Стрелки указывают возможные направления миграции прионов после их проникновения в спинной мозг.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1001257.g008

Инфицирование через структуры конъюнктивы или роговицы не требовалось, поскольку новорожденные мыши умирали от скрепи со 100% заболеваемостью, несмотря на закрытые веки.В то время как новорожденные tg a 20 , но не CD-1, у мышей наблюдалось несколько более длительное время инкубации по сравнению со взрослыми (6-8-недельными) мышами того же генотипа, анатомические структуры носоглотки (например, обонятельный эпителий и обонятельные нервы) в первый день после рождения развиваются не так, как во взрослом возрасте, что может привести к менее эффективному поглощению прионов при воздействии аэрозоля (например, через обонятельные нервы). Хотя это маловероятно, нельзя исключать, что заражение через структуры конъюнктивы или роговицы может способствовать более эффективному заражению прионами при воздействии аэрозоля.Как бы то ни было, все новорожденные мыши любого генотипа умерли от терминальной скрепи при аэрозольном заражении прионами, несмотря на отсутствие у них полностью развитых лимфоидных органов, что подкрепляет наш вывод о том, что иммунная система не нужна для передачи прионов через аэрозоли.

Таким образом, наши результаты показывают, что аэрозоли являются удивительно эффективным способом передачи прионов. Этот новый путь передачи прионов не только концептуально важен для области исследования прионов, но также выявляет до сих пор недооцененный фактор риска для лабораторного персонала и персонала мясоперерабатывающей промышленности.В свете этих выводов может оказаться целесообразным пересмотреть действующие руководства по биобезопасности, связанные с прионами, и санитарные стандарты в диагностических и научных лабораториях, которые потенциально сталкиваются с зараженными прионами материалами. Хотя мы не исследовали, достаточно ли производства прионных аэрозолей в природе, чтобы вызвать горизонтальную передачу прионов, обнаружение прионов в биологических жидкостях, таких как слюна, моча и кровь, предполагает, что, возможно, стоит проверить эту возможность в будущих исследованиях.

Материалы и методы

Заявление об этике

Животные содержались в особых условиях, свободных от патогенов, и эксперименты были одобрены и соответствовали рекомендациям Швейцарского закона о защите животных, Ветеринарное управление, кантон Цюрих. Эксперименты на мышах проводились по лицензиям 40/2002 и 30/2005 в соответствии с правилами Ветеринарного управления кантона Цюрих и в соответствии с правилами Ветеринарного управления Тюбингена.

Аэрозоли

Воздействие аэрозолей на мышей проводили в ингаляционных камерах, содержащих небулайзер (арт.№ 73-1963, Pari GmbH, Мюнхен, Германия) при давлении 1,5 бар с образованием 100% частиц размером менее 10 мкм, 60% частиц размером менее 2,5 мкм и 52% частиц размером менее 1,2 мкм. Считается, что частицы такого размера способны достигать верхних и нижних дыхательных путей [74]. Инфицированный прионами материал, используемый в этом исследовании, представлял собой штамм RML6, полученный из мозга больных мышей CD1 в ходе его 6 -го -го пассажа (RML6). Мышей подвергали воздействию аэрозольных гомогенатов мозга, инфицированных прионами, в течение одной, пяти или десяти минут.

Внутримозговая прионная инокуляция мышей

tg a 20 мышей-индикаторов инокулировали в.к. с гомогенатом ткани головного мозга с использованием объемов 30 мкл (RML6 0,1%, 3×10 5 LD 50 прионов скрепи). Животных проверяли ежедневно и умерщвляли при появлении определенных неврологических признаков, таких как тяжелые нарушения походки.

Интраназальное введение приона мышам

Мышей анестезировали гидрохлоридом кетамина/ксилазина.10 мкл RML6 (0,1%) инокулировали интраназально в каждую ноздрю и на носовой эпителий с помощью пипетки на 10 мкл. Мышей удерживали горизонтально во время процесса инокуляции и в течение 1 минуты после инокуляции. Всю процедуру повторяли после 20-минутного перерыва, достигая конечного объема 40 мкл RML6, 0,1% (4×10 5 LD 50 прионов скрепи).

Внутрибрюшинное введение приона мышам

Мышей анестезировали гидрохлоридом кетамина/ксилазина.100 мкл RML6 (0,1%) 1×10 6 LD 50 Прионы скрепи вводили внутрибрюшинно. инокулировали Rag1 -/- и γ C Rag2 -/- мышей.

Вестерн-блоттинг

Гомогенаты тканей готовили в стерильной 0,32 М сахарозе с использованием Fast Prep FP120 (Savant, Holbrook, NY, USA) или Precellys 24 (Bertin Technologies). Для обнаружения PrP Sc 15 мкл гомогената мозга расщепляли протеиназой К (30 мкг/мл) и инкубировали 30 мин при 37°С.Для обнаружения PrP C расщепление не проводили. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на PVDF (Immobilon-P, Millipore, Bedford, Mass., USA) или нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher & Söhne). Прионные белки выявляли с помощью усиленной хемилюминесценции (реагент вестерн-блоттинга, Santa Cruz Biotechnology, Гейдельберг, Германия) или ECL (от PerbioScience, Лозанна, Швейцария) с использованием мышиного моноклонального антитела против PrP POM-1 и конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) козьего антигена. -мышиное антитело IgG1 (Zymed).

Гистоблот-анализ

Было проведено

гистоблоттинга, как описано ранее [73]. Замороженный мозг, нарезанный на срезы толщиной 12 мкм, помещали на нитроцеллюлозные мембраны. Общий PrP, а также PrP Sc после расщепления 50 или 100 мкг/мл протеиназы K в течение 4 часов при 37°C определяли с помощью антиприонного антитела POM1 (1∶10000, NBT/BCIP, Roche Diagnostics). .

Гистологический анализ

Ткани, фиксированные формалином, обрабатывали концентрированной муравьиной кислотой в течение 60 минут, чтобы инактивировать инфекционность прионов.Парафиновые срезы (2 мкм) и замороженные срезы (5 или 10 мкм) головного мозга окрашивали гематоксилином/эозином. Антитела GFAP (1∶300; DAKO, Carpinteris, CA) к астроцитам наносили и визуализировали стандартными методами. Iba-1 (1∶1000; Wako Chemicals GmbH, Германия) использовали для выделения активированных клеток микроглии. Постфиксацию в формалине проводили примерно на 8 часов, а ткани заливали в парафин. После депарафинизации для окрашивания PrP срезы инкубировали в течение 6 мин в 98% муравьиной кислоте и промывали в дистиллированной воде в течение 30 мин.Срезы нагревали до 100°С в парогенераторе в цитратном буфере (рН 6,0) в течение 3 мин и давали остыть до комнатной температуры. Срезы инкубировали в буфере Ventana и окрашивали на иммуногистохимическом роботе NEXEX (Ventana tools, Швейцария) с использованием набора IVIEW DAB Detection Kit (Ventana). После инкубации с протеазой 1 (Ventana) в течение 16 мин срезы инкубировали с анти-PrP SAF-84 (SPI bio, A03208, 1∶200) в течение 32 мин. Срезы контрастировали гематоксилином.

Профилирование поражения

Мы выбрали 5 анатомических областей мозга из всех исследованных или не менее 3 мышей на экспериментальную группу.Мы оценивали спонгиоз по шкале от 0 до 4 (неопределяемый, легкий, умеренный, тяжелый и спонгиозный статус). Глиоз и иммунологическую реактивность PrP оценивали по шкале от 0 до 3 (неопределяемый, легкий, умеренный, тяжелый). Сумма трех баллов дает значение, полученное для профиля поражения для отдельного животного. «Радиолокационные диаграммы» отображают баллы губчатых изменений, глиоза и отложения PrP. Цифры соответствуют следующим отделам мозга: (1) гиппокамп, (2) мозжечок, (3) обонятельная луковица, (4) лобное белое вещество, (5) височное белое вещество.Исследователи, не идентифицировавшие животных, провели гистологический анализ.

Анализ неправильно свернутого белка (MPA)

Анализ неправильно свернутого белка

(MPA) проводили, как описано ранее [75]. Анализ, который проводили на 96-луночном планшете, разделен на две части: захват PSR1 и ELISA. Для захвата PSR1 настройка каждой реакции была следующей: 3 мкл гранул PSR1 (буфер удален) и 100 мкл 1× TBSTT добавляли гомогенатом мозга, инкубировали при 37°C в течение 1 часа при встряхивании при 750 об/мин, гранулы промывали. на промывателе планшетов (ELX405 Biotek) 8 раз с остаточным 50 мкл/лунку TBST.Затем добавляли 75 мкл/лунку денатурирующего буфера. Это инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут при встряхивании при 750 об/мин. Затем добавляли 30 мкл/лунку нейтрализующего буфера. Затем последовала дополнительная инкубация при комнатной температуре в течение 5 минут при встряхивании при 750 об/мин. Бусины притягивались магнитом. ELISA выполняли следующим образом: 150 мкл/лунку образца переносили на планшет для ELISA, который был покрыт POM19. Затем следовала стадия инкубации при 37°C в течение 1 часа при встряхивании при 300 об/мин. Его промывали 6 раз промывочным буфером.Конъюгат POM2-AP необходимо было развести до 0,01 мкг/мл в разбавителе конъюгата. Добавляли 150 мкл/лунку разбавленного конъюгата. Затем следует инкубация при 37°С в течение 1 часа без встряхивания. После 6-кратной промывки промывочным буфером готовили улучшенный субстрат путем добавления 910 мкл энхансера к 10 мл субстрата (Lumiphos plus, Lumigen). Добавляли 150 мкл/лунку усиленного субстрата. После инкубации при 37°C в течение 30 минут производилось считывание с помощью люминометра (Luminoskan Ascent) при ФЭУ по умолчанию, шкала фильтра = 1.

ОТ-ПЦР в реальном времени для количественного определения количества копий трансгена у

Prnp о/о / NSE-PrP мышей

ПЦР в реальном времени проводили на очищенной геномной ДНК из хвостов мыши на системе 7900 HT Fast Real-Time PCR System (AB).Данные были сгенерированы и проанализированы с использованием программного обеспечения SDS 2.3 и RQ manager 1.2. Были использованы следующие праймеры: Прямой отжиг праймеров в интроне 1 гена мыши Prnp : 5′ – GGT TTG ATG ATT TGC ATA TTA G – 3′. Отжиг обратных праймеров мыши Prnp гена, экзон 2: 5′ – GGA AGG CAG AAT GCT TCA GC – 3′. Продукт ПЦР имеет длину приблизительно 200 п.н. Для контроля анализировали мышиный ген лимфотоксина альфа. Использовали следующие праймеры: Прямой отжиг праймеров с экзоном 1 мышиного гена лимфотоксина альфа: 5′ – CCT GGT GAC CCT GTT GTT GG – 3′.Отжиг обратного праймера к интрону 1 гена лимфотоксина мыши мыши: 5′ – GTG GGC AGA AGC ACA GCC – 3′. Продукт ПЦР имеет длину приблизительно 160 п.н. ПЦР-анализ в реальном времени выявил 2–4 копии трансгена на аллель Prnp у мышей Prnp o/o /NSE-PrP .

Статистическая оценка

Результаты выражаются как среднее + стандартная ошибка среднего (SEM) или стандартное отклонение (SD), как указано. Статистическую значимость между экспериментальными группами оценивали с использованием непарного двухвыборочного t-критерия Стьюдента (Excel) и двухвыборочного t-критерия Велча для распределений с неравной дисперсией (R).Для анализа выживаемости кривые Каплана-Мейера-выживаемости были построены с использованием программного обеспечения SPSS или R, статистическую значимость оценивали путем выполнения логарифмических ранговых тестов (R). Подгонка линейной регрессии и дисперсионный анализ (ANOVA) проводились в R (www.r-project.org).

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Дисперсионный анализ (ANOVA) для различных генотипов в отношении времени инкубации.

Точечный график времени выживания для мышей tg a 20 , CD1, C57BL/6 и 129SvxC57BL/6 после 10-минутного воздействия IBH.Разница между генотипами достоверна (p<0,001).

10.1371/journal.ppat.1001257.s001

(0,14 МБ TIF)

Рисунок S2.

Передача прионов через аэрозоли или при интраназальном заражении не может быть непосредственно отслежена вестерн-блоттингом и РМА.

( A–D ) Вестерн-блот-анализ PrP Sc компартментов обонятельного эпителия (OE), обонятельной луковицы (OB), одного полушария головного мозга или мозжечка через 60 дней после аэрозольной инфекции у различных линий мышей (C57BL/ 6, CXCR5 -/- , CD21 -/- , Prnp о/о , CD1, LTα -/- , NSE-PrP , TN2FR1 -90 мыши).(+) и без (-) предшествующей обработки протеиназой K (PK), как указано. Молекулярные массы (кДа) указаны справа от блотов. кДа: килодальтон. β-Актин служил в качестве контроля нагрузки. ( E ) Анализ гомогенатов ткани головного мозга мышей, которым интраназально инокулировали, с помощью «анализа неправильно свернутых белков» (MPA) выявляет положительные сигналы как индикаторы отложения Prp Sc в контрольном образце (красный) и отрицательный сигнал в большинстве исследованных случаев ( синий, ниже уровня массы). В качестве контроля использовали мозг мыши дикого типа (черный).Ось Y: RLU: относительные (химические) единицы люминесценции, ось X: число мышей, синяя колонка представляет собой разведение 1∶10 10% гомогената мозга. Данные для неинфицированных контролей мозга здесь не показаны, но не показали положительного сигнала. ( F ) Анализ гомогенатов ткани обонятельных луковиц от мышей, которым интраназально инокулировали, с помощью «анализа неправильно свернутых белков» (MPA) выявляет положительные сигналы как индикаторы отложения Prp Sc в контрольном образце (красный) и у больных мышей (положительные сигналы). ).Отрицательные сигналы в большинстве других исследованных случаев (синие столбцы под контрольным уровнем веса). В качестве контроля использовали мозг мыши дикого типа (черный). Ось Y: RLU: относительные (химические) единицы люминесценции, ось X: число мышей, синяя колонка представляет собой разведение 1∶10 10% гомогената мозга. Данные для неинфицированных контролей мозга здесь не показаны, но не показали положительного сигнала.

10.1371/journal.ppat.1001257.s002

(0,68 МБ TIF)

Рисунок S3.

Подробный количественный анализ экспрессии PrP C в обонятельном эпителии и ЦНС.

( A ) Количественное определение уровней экспрессии PrP C с помощью Вестерн-блоттинга у мышей NSE-PrP , wt и tg a 20 . В обонятельном эпителии мышей tg a 20 экспрессия PrP C в ≥3,5 раз выше по сравнению с мышами дикого типа и примерно в 11 раз выше экспрессия PrP C по сравнению с мышами NSE-PrP . ( B ) В обонятельной луковице tg a 20 мышей ≥1.Экспрессия PrP C в 5 раз выше по сравнению с мышами дикого типа и более чем в 3,5 раза выше экспрессия PrP C по сравнению с мышами NSE-PrP . ( C ) В полушариях головного мозга мышей tg a 20 более чем в 2,5 раза выше экспрессия PrP C по сравнению с мышами дикого типа, и более чем в 1,5 раза выше экспрессия PrP C по сравнению с NSE-2Pr6 мышей. Молекулярные массы (кДа) указаны справа от блотов. кДа: килодальтон.β-Актин служил в качестве контроля нагрузки.

10.1371/journal.ppat.1001257.s003

(1,48 МБ TIF)

Рисунок S4.

Вовлечение селезенки после передачи прионов через аэрозоли и поражение селезенки.

( A ) TG MICE 20 MICE, ( B ) JH – / – Mice, ( C ) LTβR – / – Mice и ( D ) γ C Rag2 -/- мышей частично обнаруживают отложения в селезенке материала, устойчивого к фармакокинетике, что оценивается вестерн-блоттингом.( E ) Гистоблот-анализ селезенки мышей C57BL/6, Prnp o/o и Rag1 -/- мышей. У мышей C57BL/6 обнаруживаются отложения, устойчивые к PK, в то время как у мышей Prnp o/o и Rag1 -/- такие отложения отсутствуют. ( F ) Вестерн-блоттинг репрезентативного tg a 20 селезенки, мезентериального лимфатического узла (млн) и бронхиального лимфатического узла (млн), в которых отсутствует резистентный к ПК материал. (+) и (-) с обработкой ПК или без нее.POM1 использовали в качестве первичного антитела.

10.1371/journal.ppat.1001257.s004

(2,81 МБ TIF)

Рисунок S5.

Передача прионов интраназальным путем.

кривые выживания ( A ) C57BL / 6, ( B ) 129SVXC57BL / 6 ( C ) TG A 20 и ( D ) PRNP O / O MICE интраназально инокулировали RML6 0,1%. ( E ) Кривая выживания мышей C57BL/6, которым интраназально вводили HBH.Вестерн-блоты головного мозга мышей ( F ) C57BL/6 и мышей ( G ) tg a 20 , которым интраназально инокулировали 4×10 5 LD 50 прионов. Гомогенаты мозга анализировали с (+) и без (-) предшествующей обработки протеиназой K (PK), как указано. Гомогенат, полученный от неизлечимо больных скрепи мышей, служил в качестве положительного контроля (s: больные), а гомогенат мозга здоровой мыши C57BL/6 – в качестве отрицательного контроля (h: здоровые) соответственно.Молекулярные массы (кДа) указаны слева от блотов. ( H ) Кривые выживания мышей NSE-PrP , интраназально инокулированных прионами, показаны (левая панель) . Соответствующие вестерн-блоты мышей NSE-PrP , интраназально инокулированных прионами, показаны (правая панель) . Гомогенаты мозга анализировали с (+) и без (-) предшествующей обработки протеиназой K (PK), как указано. Гомогенат, полученный от неизлечимо больных скрепи мышей, служил в качестве положительного контроля (s: больные), а ткань здоровой мыши C57BL/6 – в качестве отрицательного контроля (h: здоровые), соответственно, и i.д. указывает на интеркуррентную смерть животного. Молекулярные массы (кДа) указаны слева от блотов. ( I ) Гистоблот-анализ мозга мышей, инфицированных прионами. Левая панель: показывает здоровый мозг мыши Prnp o/o в качестве отрицательного контроля, другие панели демонстрируют отложения Prp Sc в мозге мышей tg a 20 . Масштабные линейки указаны. ( J ) Гистологическая и иммуногистохимическая характеристика головного мозга мышей, пораженных скрепи.Срезы головного мозга мышей Prnp o/o , tg a 20 , 129SvxC57BL/6 и C57BL/6 по оценке HE (на спонгиоз, глиоз, потерю нейронов), SAF2 Sc84 (на PrP отложения), GFAP (для астроглиоза) и Iba-1 (для активации микроглии). Шкала баров: 100 мкм. ( K ) Оценка тяжести гистопатологического поражения 5 областей головного мозга, описанная в виде радиолокационного блоттинга (астроглиоз, губчатое изменение и отложение PrP Sc ) при интраназальной инокуляции мышей tg a 20 , C57BL/6 и 129Sv6xC5.

10.1371/journal.ppat.1001257.s005

(1,04 МБ TIF)

Рисунок S6.

Передача прионов интраназальным путем, контроль и поражение селезенки.

( A ) Rag1 -/- мышей интраназально инокулировали HBH (40 мкл) или ( B ) C57BL/6 интраназально инокулировали 4×10 5 LD 1 5 скобионов ( C ) γ C Rag2 -/- мышей, интраназально инокулированных HBH (40 мкл), или ( D ) мышей Balb/c, интраназально инокулированных HBH.Кривые Каплана-Мейера описывают процент выживаемости после определенных моментов времени после интраназальной инокуляции приона (ось Y представляет процент живых животных; ось X показывает время выживания в днях). Вестерн-блоты ( E ) селезенки и bln терминальных мышей Rag1 -/- , ( F ) селезенки терминальных мышей C1q a -/- , (9000ens3 G 9000ens3) терминальных мышей CD21 -/- , ( H ) селезенки терминальных мышей CXCR5 -/- , ( I ) селезенок терминальных мышей LTβR -/- , ( J ) селезенок терминальных мышей TNFR1 -/- мышей, ( K ) селезенки терминальных мышей LTα -/- и LTβR -/- и ( L ) селезенки терминальных мышей tg a 20905 26

10.1371/journal.ppat.1001257.s006

(1,41 МБ TIF)

Рисунок S7.

Гистологическое, иммуногистохимическое и иммуноблот-подтверждение прионной болезни при аэрозольной инфекции.

( A , B ) Гистологическая и иммуногистохимическая характеристика головного мозга мышей CD1, пораженных скрепи. ( A ) Показаны репрезентативные обонятельные луковицы (окрашивание HE и нейрофиламента). указаны масштабные линейки ( B ) Мозжечок (верхний ряд), средний мозг (второй ряд сверху), лобная кора (третий ряд сверху) и обонятельная луковица (нижний ряд) демонстрируют спонгиоз, астроглиоз, активацию микроглии и Prp Sc откладывается при заражении прионами через аэрозоли (окрашивание HE, GFAP, Iba-1 и SAF-84).Шкала баров: 50 мкм.

10.1371/journal.ppat.1001257.s007

(8,63 МБ TIF)

Таблица S1.

Время выживания штаммов мышей, подвергшихся воздействию прионных аэрозолей в течение различных периодов времени.

( A ) Дисперсионный анализ пластин на рис. 1F–G и рис. S1. Время воздействия аэрозольных инфекционных гомогенатов мозга, но не их концентрация, значимо коррелировало со временем выживания. ( B ) Линейная регрессия подходит для времени выживания в зависимости от времени воздействия в tg a 20 (рис.1G) и CD1 (рис. S1). Время инкубации отрицательно коррелировало с уровнем экспрессии PrP. ( C ) Парные тесты на различное среднее время выживания для мышей tg a 20 , CD1, C57BL/6 и 129SvxC57BL/6 после 10-минутного воздействия прионных аэрозолей (рис. S1), идентифицирующих гена Prnp число копий как самую сильную независимую переменную. Р <0,001: ***, Р <0,01: **, Р <0,05: *, Р <0,1.

10.1371/journal.ppat.1001257.s008

(0,06 МБ DOC)

Быстрая разработка мини-белков открывает путь к новому классу лекарств

Эти разработанные компьютером белки, ранее не существовавшие в природе, сочетают в себе стабильность и биодоступность низкомолекулярных препаратов со специфичностью и эффективностью более крупных биологических препаратов. Они не требуют охлаждения, и их, вероятно, будет легко принимать пациентам.

 «Эти мини-связывающие белки потенциально могут стать новым классом лекарств, которые ликвидируют разрыв между низкомолекулярными препаратами и биологическими препаратами.Как и моноклональные антитела, их можно сконструировать так, чтобы они связывались с мишенями с высокой селективностью, но они более стабильны, их легче производить и вводить», — сказал Дэвид Бейкер, который руководил межучрежденческим исследовательским проектом. Медицинской школы Вашингтонского университета и директора Института белкового дизайна Университета Вашингтона,

.

Бейкер и его коллеги сообщают о своих выводах в статье, опубликованной в Интернете 27 сентября журналом Nature.

Аарон Шевалье, Даниэль-Адриано Силва и Габриэль Дж.Роклин были ведущими авторами и старшими научными сотрудниками Института белкового дизайна Университета Вашингтона во время проекта.

В методе использовалась компьютерная платформа Rosetta, разработанная Бейкером и его коллегами из Вашингтонского университета. Они разработали тысячи коротких белков длиной около 40 аминокислот, которые, как предсказывала программа Rosetta, будут прочно связываться с молекулярной мишенью.

Из-за своего небольшого размера эти короткие белки, как правило, чрезвычайно стабильны.Их можно хранить без холодильника. Их также легче вводить, чем крупные белковые препараты, такие как моноклональные антитела.

Раньше такие короткие препараты, связывающие белки, обычно представляли собой модифицированные версии встречающихся в природе белков. Однако они, как правило, не были значительно лучше, чем моноклональные антитела.

Поскольку эти связывающие мини-белки представляют собой оригинальные конструкции, их можно адаптировать для более точного соответствия своим целям, и их легче модифицировать и совершенствовать.

В этом исследовании исследователи стремились разработать два набора этих белков: один набор, который предотвратит вторжение вируса гриппа в клетки, а другой, который будет связываться и нейтрализовать смертельный нервный токсин от ботулизма. Этот токсин считается потенциальным биологическим оружием.

Компьютерное моделирование определило аминокислотные последовательности тысяч коротких белков, которые соответствовали бы мишеням гриппа и ботулина и связывались с ними. Исследователи создали короткие фрагменты ДНК, которые кодировали каждый из этих белков, вырастили белки в клетках дрожжей, а затем посмотрели, насколько прочно они связываются со своими мишенями.Мишенями были гемагглютинин гриппа h2 и ботулинический нейротоксин B.

В общей сложности этот метод позволил им разработать и протестировать 22 660 белков всего за несколько месяцев. Более двух тысяч из них привязывались к своим целям с высокой близостью.

Оценка лучших кандидатов показала, что противогриппозные белки нейтрализуют вирусы в клеточной культуре, а другие разработанные белки предотвращают проникновение ботулинического токсина в клетки головного мозга.

Назальный спрей, содержащий один из специально разработанных белков, полностью защитил мышей от гриппа при введении до или через 72 часа после заражения.. Исследователи сообщают, что защита, которую обеспечивает лечение, равна или превосходит защиту, наблюдаемую с помощью антител.

Тестирование части белков показало, что они чрезвычайно стабильны и, в отличие от антител, не инактивируются высокими температурами. Небольшие белки также вызывали слабый иммунный ответ или не вызывали его вообще, что часто делает неэффективными препараты с большим белком.

Финансирование исследования поступило от стартового гранта Life Sciences Discovery Fund (9598385), Doctorado en Ciencias Bioquiacutemicas UNAM (R56AI117675), гранта на обучение по молекулярным основам вирусного патогенеза (T32AI007354-26A1), премии исследователя патогенеза инфекционных заболеваний от Burroughs. Wellcome Fund и NIH (1R01NS080833), научный сотрудник CoMotion Мэри Гейтс по инновациям; Шэньчжэньский комитет по инновациям в области науки и технологий (JCYJ20170413173837121), Гонконгский совет по исследовательским грантам (C6009-15G и AoE/P-705/16), PAPIIT UNAM (IN220516), CONACyT (254514) и Facultad de Medicina UNAM (AI0, AI123920, AI125704) ), грант NIAID (1R41AI122431) (1R21AI119258) и грант Фонда открытий в области наук о жизни (20040757).

границ | Биосенсоры показывают фармакокинетику S-кетамина в эндоплазматическом ретикулуме

Введение

Несмотря на полвека исследований и усовершенствований, антидепрессанты не работают оптимально. Хотя селективные ингибиторы обратного захвата серотонина антидепрессанты помогают значительному числу пациентов, их преимущества проявляются слишком медленно (через 2–6 недель) после начала лечения. Напротив, однократное введение относительно небольшой (субнаркозной) дозы рацемического кетамина в течение ~1 ч частично снимает депрессию менее чем за 1 день; это облегчение сохраняется в течение нескольких дней после введения (Berman et al., 2000). В некоторых доклинических исследованиях R-кетамин обладает более сильным и продолжительным антидепрессивным действием, чем S-кетамин (Hashimoto, 2019). Недавно Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило ингаляционный S-кетамин для лечения резистентной депрессии.

Однако, поскольку более высокие дозы S-кетамина имеют побочные эффекты, разработка антидепрессантов, которые действуют аналогично S-кетамину, может быть лучшей стратегией, чем использование самого S-кетамина. Чтобы разработать более эффективные быстродействующие антидепрессанты, необходимо сначала понять механизм действия S-кетамина, включая молекулярную мишень.

Большинство исследователей подчеркивают гипотезу о том, что S-кетамин оказывает антидепрессивное действие путем связывания с подтипом рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA) (MacDonald et al., 1991; Blanpied et al., 1997; Preskorn et al., 2008; Autry et al., 2011; Emnett et al., 2013; Gideons et al., 2014; Miller et al., 2014; Johnson et al., 2015). В других статьях предлагаются следующие рецепторы, каналы или транспортеры-мишени для кетамина: никотиновые рецепторы α3β2 (нАХР; Lee et al., 2012), нАХР α4β2 (Buisson and Bertrand, 1998), нАХР α7 (Coates and Flood, 2001; Moaddel et al. др., 2013), дофаминовые D2-рецепторы (Kapur and Seeman, 2001, 2002; Seeman and Kapur, 2003), каналы HCN1 (Chen et al., 2009), 5-HT2-рецепторы (Frohlich and Van Horn, 2014) или 5- Рецепторы HT3 (Yamakura et al., 2000). Большинство современных психиатрических препаратов имеют хорошо установленные мишени-рецепторы, каналы или переносчики. Напротив, «мишень» антидепрессивного действия S-кетамина плохо изучена.

Аналогичным образом мы комментируем, что нижестоящие сигнальные пути плохо изучены. Предполагаемые пути включают механистическую мишень рапамицина (mTOR; Zoncu et al., 2011; Моаддел и др., 2013; Miller et al., 2014), эукариотическая киназа фактора элонгации 2 (EEF2) (Autry et al., 2011; Gideons et al., 2014; Adaikkan et al., 2018), серин/треонинкиназа, гликогенсинтаза киназа-3 (GSK -3; Beurel et al., 2011; Liu et al., 2013), кальций/кальмодулинзависимая протеинкиназа II (CaMKII; Adaikkan et al., 2018), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF; Lepack et al., 2014), транспортные везикулы, содержащие Kir4.1 (Stenovec et al., 2019), и транслокацию G-белка в/из липидных рафтов (Wray et al., 2018). Считается, что эти молекулы участвуют в усилении глутаматергической (Zanos et al., 2018), холинергической или ГАМКергической (Widman and McMahon, 2018) передачи (Ren et al., 2016). Наконец, мы аналогичным образом прокомментируем области и ядра мозга. Большинство исследований сосредоточено на гиппокампе и коре головного мозга; но кетамин также блокирует разрыв латеральной уздечки (Yang et al., 2018).

Если мишень для наркотика неизвестна, то подходящим шагом будет поиск этой мишени во всех компартментах, содержащих лекарство, и измерение того, как долго лекарство остается в каждом компартменте.В предыдущем отчете показано, что аналог кетамина проникает в клетки (Emnett et al., 2016). В этом отчете представлены первые количественные измерения S-кетамина с динамическим разрешением в органелле: эндоплазматическом ретикулуме (ER).

Для проведения этих экспериментов мы использовали исследовательскую стратегию, аналогичную нашему предыдущему отчету по никотину (Shivange et al., 2019). Мы разработали генетически кодируемый флуоресцентный биосенсор S-кетамина. Мы нацелили биосенсор либо на плазматическую мембрану (PM), либо на ER.Затем мы выполнили измерения флуоресценции, чтобы динамически сообщать о концентрации S-кетамина в каждом отсеке.

Материалы и методы

Направленная эволюция белков iSKetSnFR с использованием анализов белков, экспрессируемых бактериями

Начиная с биосенсорных конструкций iNicSnFR (Shivange et al., 2019), мы сконструировали и измерили около 3000 мутантов в итеративных раундах сайт-насыщенного мутагенеза (SSM). Мы использовали протокол мутагенеза Quikchange (Agilent), включающий смесь трех праймеров, создав 22 уникальных кодона, кодирующих 20 канонических аминокислот (Kille et al., 2013). Процедура с 22 кодонами дает приблизительное покрытие остатков >96% для коллекции из 96 случайно выбранных клонов.

Для измерения флуоресценции в покое и индуцированной S-кетамином флуоресценции использовали 96-луночный планшетный ридер Tecan Spark M10 (оснащенный соответствующими фильтрами) (F 0 и ΔF соответственно). Бактериальные лизаты тестировали с возбуждением при 485 нм и эмиссией при 535 нм. Перспективные клоны были амплифицированы и секвенированы. Наиболее чувствительная конструкция в каждом раунде SSM использовалась в качестве шаблона для следующего раунда SSM.

Измерения на очищенных конструкциях iSketSnFR

Биосенсоры, отобранные для дальнейшего исследования, были очищены последовательностью His 6 , включенной в бактериальный вектор экспрессии (Shivange et al., 2019). Белки очищали иммобилизацией в фосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7,4, и элюцией в градиенте имидазола (10–200 мМ). Белки концентрировали центрифугированием через колонку с отсечкой 30 кДа и диализом против PBS. Диализованный белок количественно определяли с использованием спектрофлуориметра с нанокаплями, и 50 или (предпочтительно) 100 нМ использовали в исследованиях доза-реакция для характеристики ответов на различные лиганды.Зависимость доза-реакция для лигандов определяли с помощью планшетного ридера. Зависимые от рН исследования реакции на дозу с очищенными конструкциями iSketSnFR проводили с использованием 3× буферов PBS.

Экспрессия в клетках млекопитающих

Мы сконструировали два варианта биосенсоров iSKetSnFR1 и iSketSnFR2 для экспрессии в клетках млекопитающих. Варианты плазматической мембраны (_PM) и эндоплазматического ретикулума (_ER) были сконструированы с помощью процедуры кольцевого клонирования полимеразы. Для iSketSnFR1_PM и iSKetSnFR2_PM мы клонировали бактериальные конструкции в pCMV(MinDis), вариант pDisplay (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США), лишенный метки гемагглютинина (Marvin et al., 2013). Мы модифицировали предыдущий трансмембранный домен (Shivange et al., 2019) следующим образом. Мы заменили терминальный KKPR рецептора PDGF (предполагаемый мотив удержания ER) на KYLQKRRERRRQ (мотив экспорта p14 Golgi) и ENANSFCYENEVAL (предполагаемый мотив экспорта Kir2.X ER). Чтобы создать iSketSnFR1_ER и iSketSnFR2_ER, мы заменили 14 С-концевых аминокислот (QVDEQKLISEEDLN, включая тег Myc) мотивом удержания ER, QTAEKDEL (Shivange et al., 2019).

Мы провели эксперименты по трансфекции кДНК iSketSnFR1_PM, iSKetSnFR2_PM, iSketSnFR1_ER и iSketSnFR2_ER в клетках Neuro2a.Клетки Neuro2a были приобретены в ATCC и культивированы в соответствии с протоколами ATCC. Для химической трансфекции мы использовали Липофектамин 2000 или Липофектамин 3000, следуя протоколу, рекомендованному производителем. Клетки инкубировали в среде для трансфекции в течение 24 часов, а затем в ростовой среде в течение ~ 24 часов перед визуализацией.

Экспрессия в дофаминергических нейронах, дифференцированных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)

Fujifilm CDI (ранее называвшаяся Cellular Dynamics International, Мэдисон, Висконсин, США) поставила iCell DopaNeurons.Это дофаминергические нейроны человека, дифференцированные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Поставщик измерил, что 89% клеток являются положительными по тирозингидроксилазе с помощью флуоресцентной сортировки клеток. iCell DopaNeurons поддерживали в 95% среде BrainPhys Neuronal (STEMCELL Technologies), 2% iCell Neural Supplement B (CDI), 1% iCell Nervous System Supplement (CDI), 0,1% 1 мг/мл ламинина (Sigma), 1% Добавка N-2 100× (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) с добавлением пенициллина и стрептомицина.iCell DopaNeurons выдерживали на чашках в течение 17–24 дней перед визуализацией. Стеклянное дно 35-мм чашек для визуализации (MatTek) покрывали ~0,07% раствором полиэтиленимина и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Чашки ополаскивали PBS, затем ополаскивали водой и сушили на воздухе в течение ночи. Затем дно стекла покрывали раствором ламинина с концентрацией 80 мкг/мл в течение 30 мин при 37°C перед посевом клеток. Мы подтвердили, что ≥40% клеток, окрашенных на ТГ, с помощью иммуноцитохимии с использованием ранее описанного анализа (Srinivasan et al., 2016).

культивируемых iCell DopaNeurons трансфицировали через 13 или 21 день культивирования с использованием набора Viafect (Promega, № по каталогу E4981) при соотношении реагент для трансфекции (мкл): ДНК (мкг) 4:1. Смесь для трансфекции готовили в 100 мкл OptiMEM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), содержащей 4 мкл реагента для трансфекции Viafect и 1 мкг кДНК. Смесь инкубировали в течение 10–15 мин, затем добавляли непосредственно в свежую поддерживающую среду в культуральной чашке. Среду для трансфекции удаляли через 24 часа, а клетки инкубировали еще в течение 48–72 часов перед визуализацией.

Измерения флуоресценции с временным разрешением в живых клетках млекопитающих

Мы обнаружили, что сигналы с конструкциями iSKetSnFR имеют яркость, аналогичную сигналам предыдущих биосенсоров iNicSnFR на основе cpGFP для никотина (Shivange et al., 2019), но динамический диапазон несколько ниже для iKetSnFR. Наборы данных были получены на микроскопе Olympus IX-81 в режиме широкопольной эпифлуоресценции. Изображения были получены со скоростью 3–4 кадра/с с помощью камеры EMCCD с задней подсветкой (iXon DU-897, Andor Technology USA, South Windsor, CT, USA; Pantoja et al., 2009), управляемый программным обеспечением Andor IQ2 или IQ3. Описаны измерения флуоресценции при λ ex = 470 нм (Shivange et al., 2019). Мы также установили второй светодиод для возбуждения на длине волны 405 нм. Куб эпифлуоресценции был описан ранее (Srinivasan et al., 2011). Линза 40× оказалась наиболее удобной для визуализации нескольких соседних клеток и была относительно нечувствительна к умеренному смещению фокуса. Конструкции, направленные на PM, измеряли с областью интереса (ROI), которая включала только периферию клетки.

Растворы подавались из приподнятых резервуаров самотеком через соленоидные клапаны (Automate Scientific, Беркли, Калифорния, США), затем по трубкам подавались в коллектор со скоростью 1–2 мл/мин. Эксперименты проводили с буфером HBSS, за исключением того, что нейроны, полученные из иПСК, исследовали в PBS плюс D-глюкоза (5,56 мМ), MgCl 2 (0,49 мМ), MgSO 4 (0,4 мМ), KCl (5,33 мМ), и CaCl 2 (1,26 мМ). Описаны и другие детали (Shivange et al., 2019).Как обычно в экспериментах по визуализации флуоресценции, мы исключили данные самых ярких клеток, потому что они могут иметь флуоресцентные примеси или агрегаты, которые создают быстро обесцвечивающуюся базовую линию. Процедуры анализа данных включали вычитание пустых (внеклеточных) областей и поправки на дрейф базовой линии.

Конфокальная флуоресцентная визуализация

Для лазерного сканирования конфокальной флуоресцентной визуализации клетки Neuro2a трансфицировали iSKetSnFR1_PM, iSKetSnFR2_PM, iSketSnFR1_ER или iSketSnFR2_ER (0.5 мкг) с помощью Липофектамина 2000 или Липофектамина 3000, используя протокол, рекомендованный производителем. Изображения были получены с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Zeiss LSM 710, оснащенного объективом 63× NA 1,4. HBSS использовали для промывки и замены питательной среды в чашках перед визуализацией. Освещение GFP было при 488 нм, наблюдаемое через полосовой фильтр 495–550 нм.

S-образный склон

Мы вводим удобную метрику для обобщения прогресса в разработке все более чувствительных флуоресцентных биосенсоров для лекарств.Показатель S-наклон особенно подходит для низких концентраций лекарственного средства, поскольку он соответствует взаимосвязи между [лекарственным средством] и ΔF в начале зависимости доза-реакция. Мы определяем S-наклон для использования с биосенсорами лекарств на основе интенсивности:

S-наклон = Δ(FF0)/(Δ[препарат]).

Мы указываем S-наклон в единицах мкМ −1 .

В этой статье используется S-образный наклон для измерений биосенсоров S-кетамина в бактериальных лизатах, с очищенными белками и экспрессированными в клетках.Для измерений с бактериальными лизатами и с очищенными белками обычно можно построить полную зависимость доза-реакция с коэффициентом Хилла, близким к 1. В этом случае мы рассчитали (как на рис. 2А ниже)

Рисунок 1 . Структуры S-кетамина и R-кетамина.

Рисунок 2 . Последовательности, зависимость доза-реакция и рН-зависимость iSketSnFR1, iSketSnFR2 и родственных белков. (A) Последовательности восьми изученных iKetSnFR.Имена iSketSnFR1 и iSketSnFR2 соответствуют AK2 и AK8. Функциональные области биосенсорного белка показаны пунктирными ячейками над последовательностями. Выделенные области включают области, окружающие лиганд («сайт связывания»), интерфейс между PBP и фрагментом cpGFP, две линкерные последовательности, ведущие от PBP к cpGFP и наоборот, и шарнир PBP. Также показаны N- и С-концевые аминокислоты. Нумерация соответствует записи PDB 6EFR (Shivange et al., 2019). Фрагмент cpGFP, не показанный, проходит от кодона 80 до 320.Греческими буквами обозначены ароматические группы, которые были кандидатами на катион-π-взаимодействия с атомом N лиганда (Shivange et al., 2019), а красными границами обозначены группы с наиболее убедительными доказательствами. Показанные остатки были мутированы в этом исследовании или в предыдущем исследовании, в котором были созданы биосенсоры iNicSnFR. Фоновые цвета для аминокислот, аналогичные цветам в JMOL, не имеют химического значения, но выбраны для обеспечения широкого, различимого диапазона цветов. Нет соответствия между цветом фона пунктирных записей и цветом фона кодонов. (B1) Зависимость доза-реакция для очищенного iSketSnFR1, изученная для различных лигандов при pH 7,0, 3-кратном фосфатно-солевом буфере (PBS; Shivange et al., 2019). Данные для S-кетамина подгоняли под уравнение Хилла, ΔF max /F 0 = 3,4 ± 0,1 и EC 50 10,7 ± 1,5 мкМ, коэффициент Хилла (n H ) = 0,91 ± 0,09. Другие семь протестированных лигандов дали ответы, которые были слишком малы для систематического изучения. (B2) Зависимость доза-реакция для очищенного iSketSnFR2, изученная для различных лигандов при pH 7.0, 3× PBS (Shivange et al., 2019). Данные для S-кетамина подгоняли под уравнение Хилла, ΔF max /F 0 = 3,0 ± 0,3 и EC 50 1,16 ± 0,6 мкМ, коэффициент Хилла (n H ) = 1,18 ± 0,07. Другие 12 протестированных лигандов дали ответы, которые были слишком малы для систематического изучения. (C) Параметры доза-реакция при различных значениях pH от 6,0 до 8,5 для S-кетамина в очищенных iSketSnFR1 и iSketSnFR2. Данные включены для подборов кривых, которые дали значения n H между 0.75 и 1.2 и EC 50 значения < 50 мкМ. Графики показывают, что iSketSnFR2 имеет наиболее благоприятный S-образный наклон при всех исследованных значениях pH как из-за его более низкой EC 50 , так и из-за его более высокого ΔF max /F 0 .

Реагенты

Все приобретенные растворители были аналитической чистоты и использовались без дополнительной очистки. S-кетамина HCl был приобретен у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США; Кат. № K1884, CAS № 33643-47-9. Мы приобрели R-кетамина HCl у Cayman Chemicals (Анн-Арбор, Мичиган, США; Кат. .№ 16519, CAS № 33795-24-3).

Анализ данных

Файлы видеоизображений, спектральные данные и данные доза-реакция были дополнительно проанализированы и представлены с помощью программного обеспечения общего назначения. Эти программы включают ImageJ2 (Rueden et al., 2017), Excel (Microsoft) и Origin (OriginLab). Во всех анализах секвенирования использовали Benchling.

Результаты

Разработка iSKetSnFR1 и iKetSnFR2

Мы протестировали S-кетамин и R-кетамин (рис. 1) против iNicSnFR1, iNicSnFR2 и iNicSnFR3a, а также против 12 других биосенсоров из серии, которая привела к iNicSnFR (Shivange et al., 2019). Мы не обнаружили заметного увеличения флуоресценции, активированного S-кетамином, при концентрациях <100 мкМ.

Для дальнейшего понимания мы компьютерным путем подключили S-кетамин к структуре iNicSnFR1 (файл PDB 6EFR) и к нескольким вариантам, подвергшимся компьютерным мутациям (дополнительный рисунок S1). В результатах с наивысшим рейтингом предсказанные расстояния между атомом N S-кетамина и ароматическими группами слишком велики для образования взаимодействия катион-π типа, предложенного стыковочными, структурными и мутационными исследованиями для серии iNicSnFR с никотином. ацетилхолин и варениклин (Shivange et al., 2019). Эти наблюдения, хотя и эвристические и не окончательные, предполагают, что мы мутируем ароматические остатки.

Когда мы применили SSM к положению Tyr357, мы обнаружили ответы S-кетамина, но только для остатка Gly в положении 357 (ΔF/F 0 ~0,12 при 1 мкМ). Хотя эта конструкция (AK1) была недостаточно чувствительна для систематических измерений, она стала отправной точкой для дальнейших экспериментов с SSM.

После того, как мы идентифицировали AK1, дальнейшие раунды SSM (с сохранением кодона Gly357) привели к улучшениям за счет мутаций в сайте лиганда и рядом с ним, включая положения 10, 436 и 457.Конструкция iSketSnFR1 имеет S-наклон 0,32 мкМ -1 , что почти равно наклону никотина для iNicSnFR3a и iNicSnFR3b (Shivange et al., 2019). Таким образом, in vitro , можно ожидать ответ на 1 мкМ S-кетамина ΔF/F 0 = 0,32. Фактически записанные данные в ячейках находились в этом диапазоне (см. ниже). Кульминацией серии разработок стал iSketSnFR2, который имеет S-наклон 1,87 мкМ -1 (рис. 2).

Мы отмечаем наличие мутации Phe436Trp (относится к исходному периплазматическому связывающему белку OpuBC).Один конформер боковой цепи Trp может вписаться в вакансию, оставленную отсутствием боковой цепи в Gly357. Эта комбинация может восстановить взаимодействие катиона-π с азотом кетамина; дальнейший структурный анализ проверит эту гипотезу.

Мы также отмечаем существенное повышение чувствительности к кодону Met10 (от AK7 до iSketSnFR2). У нас нет явного структурного объяснения эффективности этой мутации.

pH-зависимость iKetSnFRs

Исследования зависимости семейства GCaMP от pH обеспечивают механистический фон для других биосенсоров, использующих cpGFP.В неактивной конформации cpGFP флуорофор имеет pKa 8–9, а второй при более высоком, лишь приблизительно характеризуемом pH. При нейтральном рН флуорофор почти полностью протонирован, уменьшая поглощение в полосе с центром при λ ex ~485 нм (Barnett et al., 2017). В активной форме рКа составляет ~7, так что некоторые молекулы флуорофора депротонированы. Это обеспечивает абсорбцию и флуоресценцию (Barnett et al., 2017). Возможно, на измерения с iSketSnFR1 и iSketSnFR2 влияет как рН-зависимость биосенсора, так и лиганда.

Таким образом, в диапазоне pH от 6 до 8,5 мы определили зависимость ΔF от дозы iSketSnFR1 и iSketSnFR2 с использованием возбуждения при λ ex = 485 нм (рис. 2C). Наибольший S-образный наклон наблюдается при pH 7,0–8,5, что является результатом максимального ΔF max /F 0 при pH 6,5–7 и ЕС 50 , которое монотонно уменьшается с увеличением pH. Обе эти тенденции напоминают результаты с семейством iNicSnFR (Shivange et al., 2019). Для измерений при λ ex = 400 нм см. рисунок 7 ниже и дополнительный рисунок S2.

Рисунок 3 . Конфокальная визуализация. (A) Типичная картина флуоресценции плазматической мембраны (PM) репрезентативной клетки Neuro2a, трансфицированной iSketSnFR2_PM. Панель (B) Типичная картина внутриклеточной флуоресценции репрезентативной клетки Neuro2a, трансфицированной iSketSnFR2_ER.

Рисунок 4 . Волны флуоресценции в клетках Neuro2a, трансфицированных конструкциями iSketSnFR1. Клетки Neuro2a, трансфицированные iSketSnFR1_PM или iSketSnFR1_ER, подвергали воздействию 20-секундных импульсов S-кетамина в различных концентрациях с интервалами в 40 секунд.За нисходящим рядом концентрации следовал восходящий ряд. (A) iSKetSnFR2_PM, среднее значение по 10 клеткам ± стандартная ошибка среднего. (B) iSketSnFR2_ER, среднее из 10 клеток ± SEM.

Рисунок 5 . Формы флуоресценции в клетках Neuro2a, трансфицированных конструкциями iSketSnFR2 и подвергнутых воздействию субмкМ S-кетамина. На трансфицированные клетки Neuro2a воздействовали сериями 10-секундных импульсов S-кетамина с возрастающей концентрацией с интервалами 20 с. (A) iSKetSnFR2_PM, среднее значение по 10 клеткам ± стандартная ошибка среднего. (B) iSketSnFR2_ER, среднее из 10 клеток ± SEM. (C) Расчеты S-наклона из линейных подгонок к данным ΔF/F 0 для последних 5 с каждого приложения.

Рисунок 6 . Формы флуоресценции в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК), трансфицированных конструкциями iKetSnFR1. Дофаминергические нейроны, дифференцированные из ИПСК, трансфицировали (А) iSketSnFR1_PM или (Б) iSketSnFR1_ER. S-кетамин перфузировали в различных концентрациях в течение 20 с с интервалом в 38 с.Среднее значение пяти клеток, ± SEM. (C) Расчет S-образного уклона. (D) Усредненные формы сигналов для (B) на расширенной оси времени.

Рисунок 7 . 485 против 400 нМ возбуждения. (A) Зависимость доза-реакция в растворе iSketSnFR2, возбужденном при 400 и 485 нм. (B) Визуализация живых клеток для iSketSnFR1 с возбуждением на длине волны 485 или 400 нм. Импульсы различной концентрации S-кетамина продолжительностью 20 с с интервалом в 40 с.

Аналог никотина с постоянным зарядом, N’-метилникотиний, ранее предоставил дополнительную информацию для семейства iNicSnFR (Shivange et al., 2019). Аналогичное производное S-кетамина, N,N-диметил-S-кетамин, не вызывало надежной активации конструкций iSketSnFR, что мешало экспериментам по изучению возможной роли заряда на атоме азота. Это согласуется с уменьшением роли катион-π-взаимодействий между S-кетамином и биосенсором, но не доказывает этого. Независимо от лежащего в основе механизма, данные свидетельствуют о том, что в зависимости iSketSnFR1 и iSketSnFR2 от pH преобладает зависимость фрагмента cpGFP, а не слабоосновного лиганда, S-кетамина.

Конструкции _PM и _ER достигают намеченных органелл

Мы исследовали субклеточную локализацию конструкций iSKetSnFR2_PM и iSketSnFR2_ER с помощью конфокальной микроскопии (рис. 3). Конструкция iSKetSnFR2_PM показывает ожидаемую локализацию на периферии клетки (рис. 3А). Конструкция iSketSnFR2_ER показывает ожидаемую внутриклеточную локализацию, включая ядерную пластинку (рис. 3В). Клетки Neuro2a не идеальны для различения органелл, и возможно, что некоторая флуоресценция возникает из-за локализации как в ER, так и в Гольджи.Для обеих конструкций iSKetSnFR2_PM и iSketSnFR2_ER мы отметили явное увеличение флуоресценции при добавлении 1,5 мкМ S-кетамина. Мы систематически описывали это увеличение в специализированных экспериментах с временным разрешением, хотя и с более низким разрешением, представленных ниже. Аналогичные изображения были получены для iSketSnFR1_PM и iSketSnFR1_ER.

Ответы с временным разрешением на S-кетамин в живых клетках

S-наклон iSketSnFR1 для S-кетамина примерно равен наклону никотина для iNicSnFR3a и iNicSnFR3b.Как и ожидалось, исходя из этого сходства, iSketSnFR1 обеспечивал значимые зависимости доза-реакция с временным разрешением для S-кетамина при концентрациях >1 мкМ (рис. 4). Трансфицированные клетки Neuro2a легко демонстрировали ΔF в течение нескольких секунд после того, как внешний раствор был заменен раствором, содержащим S-кетамин; и флуоресценция снизилась до исходного уровня в течение нескольких секунд после того, как раствор для наружного применения был заменен раствором, не содержащим кетамина. Полумаксимальная концентрация S-кетамина составляет ~ 10 мкМ, что близко к концентрации, измеренной с очищенным белком.

Быстрое антидепрессивное действие S-кетамина проявляется после пиковых концентраций в плазме крови 0,2–1 мкМ, а свободная концентрация S-кетамина в мозге может быть аналогичной (Lester et al., 2012; Janssen Research and Development, 2019). Хотя коэффициент Хилла, близкий к единице, подразумевает, что измерения при [S-кетамине] > 1 мкМ могут быть линейно экстраполированы, чтобы обеспечить значимое понимание более низких значений [S-кетамина], мы искали прямые измерения при фармакологически значимом [S-кетамине]. Нашим самым мощным и чувствительным инструментом для такого исследования является iSketSnFR2 с S-наклоном, равным 1.9 мкМ -1 в очищенном белке. Трансфицированные клетки Neuro2a легко демонстрировали измеримую ΔF в течение нескольких секунд после того, как внешний раствор был заменен на раствор S-кетамина; и флуоресценция снизилась до исходного уровня в течение нескольких секунд после того, как внешний раствор был заменен раствором, не содержащим кетамина (рис. 5). Мы нанесли на график данные для [S-кетамина] ≤1 мкМ, что меньше, чем EC 50 , измеренное с очищенным белком iSketSnFR2. Это гарантирует, что наши измерения остаются на линейной части обычной зависимости доза-реакция.Суммируя наши эксперименты с клетками, экспрессирующими целевые конструкции iSketSnFR2 для [S-кетамина] <1 мкМ, iSketSnFR2_PM показал S-наклон = 0,42 ± 0,14 мкМ -1 (среднее значение ± стандартное отклонение, всего 25 клеток из двух независимых трансфекций), а iSketSnFR_ER показал S-наклон = 0,29 ± 0,04 мкМ -1 (среднее значение ± стандартное отклонение, всего 25 клеток из двух независимых трансфекций). Эти S-образные наклоны существенно не различаются.

Ответы с временным разрешением на S-кетамин в дофаминергических нейронах, полученных из иПСК

Мы также изучали ИПСК, дифференцированные в дофаминергические нейроны (Shivange et al., 2019) и трансфицировали либо iSketSnFR1_PM, либо iSketSnFR1_ER. В этих клетках ответы на S-кетамин появлялись и уменьшались уже через несколько секунд после скачков внеклеточной концентрации S-кетамина (рис. 6), напоминая результаты в клетках Neuro2a. Ответы увеличивались линейно с концентрацией, когда мы применяли S-кетамин в концентрациях < EC 50 (рис. 6). Экспериментально определенный S-наклон для iSketSnFR1_PM составил 0,1 мкМ -1 , или примерно в 4 раза ниже, чем значение, измеренное для iSKetSnFR2_PM в клетках Neuro2a.Важно отметить, что конструкции iSketSnFR1_ER в iPSC показали S-наклон лишь немного больше, чем у конструкции iSketSnFR1_PM.

S-наклоны, измеренные для конструкций PM и ER в клетках, в несколько раз ниже, чем для очищенных белков iSketSnFR, что также наблюдается для конструкций iNicSnFR (Shivange et al., 2019). Кроме того, S-наклоны, измеренные в клетках для конструкций iSketSnFR2, примерно в 2–4 раза выше, чем для iSketSnFR1, а не в 5,8 раза выше, чем для очищенных белков-биосенсоров.Оба эти различия, по-видимому, возникают из-за того, что клеточные эксперименты внесли заметный вклад в F 0 от других флуоресцентных молекул. Требуются дальнейшие эксперименты с различными оптическими схемами и с различными типами клеток. Основной вывод состоит в том, что для двух типов клеток и двух белков-биосенсоров iSketSnFR концентрация S-кетамина в ЭР следует за внеклеточной концентрацией в течение нескольких секунд и в 2 раза.

Возбуждение при 400 нм по сравнению с 485 нм

Предыдущие исследования показывают, что датчики на основе cpGFP также могут предоставлять информацию при возбуждении на длине волны 400 нм (Barnett et al., 2017). В тестах при pH 7 мы обнаружили, что EC 50 заметно не отличается при 400 и 485 нм, как будто измерения обнаруживают общее событие связывания и конформационного изменения (рис. 7A). S-наклон при pH 7 составляет -0,23, что примерно в 7 раз меньше, чем при 485 нм (и противоположно по знаку). С помощью iSketSnFR1_ER мы проверили, можно ли отслеживать поступление S-кетамина в ER при λ ex = 400 нм, даже несмотря на то, что более низкий наклон S приводит к более низкому отношению сигнал/шум. Как показано на Фигуре 7В, это возможно, но только при [S-кетамине] в более высоком диапазоне зависимости доза-реакция.

При измерениях на очищенном iSketSnFR2 мы сравнили чувствительность pH для измерений при λ ex = 400 нм и при λ ex = 485 нм. Мы подтвердили, что EC 50 для S-кетамина остается примерно одинаковым при тестировании при λ ex = 400 нм против 485 нм, увеличиваясь при более низком pH (сравните рисунок 2C с дополнительным рисунком S2). Аналогичная тенденция ранее была отмечена для iNicSnFR3a. Эта тенденция противоположна ожидаемому ответу, ограниченному только долей протонированного лиганда в растворе (Shivange et al., 2019). Таким образом, мы повторяем предыдущее предположение о том, что в зависимости от pH измерений S-кетамина с сенсорами iSketSnFR преобладает pH-чувствительность белка биосенсора, а не лиганда S-кетамина. Из-за этой чувствительности [S-наклон] для λ ex = 400 нм становится довольно маленьким при pH <7, никогда не превышая 0,3 даже для iSketSnFR2 (дополнительный рисунок S2).

Обсуждение

S-кетамин в органеллах

Как указывалось в разделе «Введение», при отсутствии надежной информации о мишени лекарственного средства необходимо знать, в какие компартменты проникает лекарство, как быстро и в каких концентрациях.В настоящем исследовании установлено, что S-кетамин проникает в ЭПР в течение нескольких секунд после появления рядом с клетками, а затем покидает его в течение нескольких секунд после удаления S-кетамина из внеклеточного пространства. Концентрация S-кетамина в ЭР менее чем в 2 раза отличается от таковой во внеклеточном растворе. Эти выводы основаны на данных о двух биосенсорных конструкциях (iSketSnFR1, iSketSnFR2) и двух типах клеток (Neuro2a и дофаминергических нейронах человека, дифференцированных из ИПСК).

В предыдущем отчете показано, что кетамин проникает в клетки (Emnett et al., 2016). Фармакологическая роль проникновения в органеллы может различаться у никотина и S-кетамина; первый был изучен в предыдущей статье о проникновении ER (Shivange et al., 2019). Для никотина ER является основным компартментом, имеющим отношение к фармакологическому сопровождению и усилению регуляции — ранним стадиям никотиновой зависимости (Henderson and Lester, 2015). Для S-кетамина, если взаимодействие с мишенью происходит в органелле, а не в PM, эта органелла все еще неизвестна. Рецептор сигма-1, сайт связывания как R-кетамина, так и S-кетамина, находится в ER (Su, 2019).

Другие органеллы также следует рассматривать как возможные компартменты для целевого воздействия S-кетамина. В 1974 г. впервые было указано, что слабые основания накапливаются, возможно, в 100 раз в лизосомах и других кислотных компартментах (de Duve et al., 1974). Согласно одному из предположений, соответствующие компартменты для S-кетамина представляют собой кислые везикулы (Lester et al., 2015; Stenovec et al., 2019). Неопределенность в отношении соответствующих кислых везикул подразумевает, что соответствующий рН составляет от 4,5 (лизосомы) до 5.5 (синаптические пузырьки). Дальнейшие неопределенности в отношении проницаемости кетамина в заряженном состоянии допускают широкий диапазон интралюминального [S-кетамина] (Trapp et al., 2008). Поэтому будет важно непосредственно изучить внутрипросветную концентрацию S-кетамина.

В литературе по фармакокинетике указывается, что лизосомы (pH ~4,5), составляющие всего ~1% объема клетки, могут накапливать столько же слабоосновного препарата, сколько и вся цитоплазма (Smith et al., 2012). Нейролептики, также являющиеся слабыми основаниями, накапливаются в синаптических везикулах (рН ~5.5), а их высвобождение с помощью пресинаптических потенциалов действия имеет как пре-, так и постсинаптические последствия (Trapp et al., 2008; Tischbirek et al., 2012; Tucker et al., 2015; Walters and Levitan, 2019). Настоящие данные обеспечивают основу для модификаций iSKetSnFR1 и iSKetSnFR2, которые также функционируют в кислых везикулах.

Другие кандидаты на аналоги кетамина и метаболиты

К быстродействующим антидепрессантам-кандидатам относятся R-кетамин, а также такие метаболиты, как (2R, 6R)-гидроксиноркетамин (HNK) и (2S, 6S)-HNK.Скополамин также обладает быстрым антидепрессивным действием (Wohleb et al., 2016). Биосенсоры, протестированные в наших экспериментах, реагируют, хотя и довольно слабо, на некоторые из этих соединений (дополнительная фигура S3). В предыдущих экспериментах серия iNicSnFR «эволюционировала» из исходных биосенсоров, характеризующихся S-наклоном ~10 –5 (Shivange et al., 2019). Стратегия, которую мы описываем, предположительно может быть распространена на эти лиганды.

Технические аспекты биосенсоров лекарственных средств

Мы комментируем разработку «iDrugSnFRs», биосенсоров для синтетических и эндогенных наркотиков.В некоторой степени соображения отличаются от биосенсоров для эндогенных нейротрансмиттеров. Для сравнения между биосенсорами на основе интенсивности, такими как конструкции на основе PBP или рецептора, связанного с G-белком (GPCR), в этой статье подчеркивается S-наклон, единственный показатель, который суммирует начало отношения доза-реакция. S-образный наклон представляет собой просто ΔF max /F 0 , деленное на EC 50 . S-образный наклон имеет размеры, мкМ −1 . Использование S-образного наклона имеет следующие преимущества.

(1) По нашему опыту с изолированными клетками и системами in vivo , два фактора обычно делают желательным следить за течением времени относительно низких концентраций лекарственного средства. Во-первых, фармакологическая полумаксимальная доза часто меньше ЕС 50 , характеризующей флуоресценцию. S-образный наклон описывает чувствительность в соответствующем диапазоне концентраций. Во-вторых, полная зависимость доза-реакция в органеллах живых клеток может быть затруднена, если более высокие концентрации лекарственного средства ингибируют переносчики, закорачивают протонные градиенты или насыщают буферы.

(2) Увеличенный S-наклон [педантично, увеличенный (S-наклон)] означает повышенную чувствительность. Влияние других лекарств или нейротрансмиттеров (опять же, в довольно низких концентрациях) можно просто выразить как отношение S-наклонов. Это полезное сравнение, если либо EC 50 , либо ΔF max / F 0 , либо оба изменяются среди лигандов. В случае iSketSnFR1 и iSketSnFR2 все другие измеренные нами лиганды имеют настолько низкие отклики ΔF, что S-наклон можно приблизительно определить только путем экстраполяции при более высоких концентрациях (дополнительная фигура S3).R-кетамин, еще один представляющий интерес лиганд, который дает обнаруживаемые ответы при концентрациях > 100 мкМ, имеет наклон S по крайней мере в 100 раз ниже, чем S-кетамин в iSketSnFR2.

В этой статье показано, что S-образное сравнение данных по очищенным белкам имеет некоторую прогностическую ценность. Однако S-наклоны в клетках между iSketSnFR1 и iSketSnFR2 различались меньшими коэффициентами, чем измеренные с очищенным белком, предположительно потому, что в клетках эндогенные флуоресцентные молекулы увеличивают значения F 0 .

(3) Использование одного параметра позволяет оценить наименьшую наблюдаемую концентрацию аналита, особенно если вы охарактеризовали измерения флуоресценции в своих приборах для визуализации. В изолированных клетках, которые имеют благоприятные флуоресцентные свойства, мы обнаружили, что наши инструменты позволяют легко разрешить значения ΔF/F 0 , равные 0,1. Таким образом, S-наклон 0,3, 1, 3 или 10 (Shivange et al., 2019) позволяет проводить измерения до ~ 0,3 мкМ, ~ 0,1 мкМ, 10 нМ или 3 нМ соответственно.

(4) Использование S-наклона является более общим, чем предыдущая метрика, ΔF/F 0 при 1 мкМ лиганда (Shivange et al., 2019). Как отмечалось выше, эта общность позволяет легко расширять эксперименты, в которых используются только субмикромолярные концентрации лекарств. S-образный наклон также можно применять для снижения флуоресценции, например, при возбуждении на длине волны 400 нм (рис. 7). Поскольку флуоресценция не может стать меньше нуля, ΔF/F 0 никогда не может стать более отрицательной, чем -1. Однако EC 50 может стать настолько малым, что значения S-наклона станут более отрицательными, чем -1 мкМ -1 .

Использование S-образного наклона требует упрощений, которые происходят как с флуоресцентными биосенсорами на основе PBP, так и на основе GPCR. Этих упрощений может не произойти с менее прямыми датчиками, такими как те, которые измеряют потоки Ca (Ding et al., 2019) или активацию генов (Bick et al., 2017). Одно упрощение, подходящее как для биосенсоров на основе PBP, так и на основе GPCR: наклон Хилла близок к единице, так что ответы < EC 50 остаются линейными с [препаратом].

Прямой выбор, основанный исключительно на S-образном наклоне, возможен, потому что здесь, как в Shivange et al.(2019), связывание и конформационные изменения происходят достаточно быстро, чтобы устранить проблемы, вызванные реакцией самого сенсора. Однако очень низкие K d отойдут от этого опыта. С простейшей точки зрения, равновесие EC 50 (K d ) представляет собой соотношение двух (возможно, составных) кинетических стадий, феноменологически характеризуемое как K d = k off /k on . По нашему опыту, значения k на для биосенсоров на основе OpuBC составляют ~ 10 7 /М/с (Shivange et al., 2019). Следовательно, значения K d < 10 -7 M (100 нМ) сопровождаются k off <1/с. Такие значения будут давать «задержку» > 1 с между концентрацией лекарственного средства и реакцией флуоресценции.

Важным заключительным предположением является то, что измерений in vitro и измерений in vivo происходят при одном и том же pH. S-наклон действительно зависит от pH, потому что его числитель и знаменатель меняются в зависимости от pH (рисунок 2C, дополнительный рисунок S2; Barnett et al., 2017; Шиванге и др., 2019). Мы хотели бы распространить измерения iDrugSnFR на кислые органеллы. С iDrugSnFR на основе PBP-GFP это пока невозможно: S-наклон приближается к нулю.

Перспективы разработки улучшенных быстродействующих антидепрессантов

Знание того, что S-кетамин проникает в органеллы, само по себе не позволит разработать новый антидепрессант, работающий в течение 24 часов. Тем не менее, такие данные могут помочь проверить, следует ли учитывать новые механизмы, такие как действие на внутриорганеллярные мишени и субклеточную фармакокинетику, при разработке таких лекарств.Исследователи могут захотеть протестировать субклеточную фармакокинетику, мишени, компартмент взаимодействия с мишенью и последующие сигнальные события других кандидатов в качестве быстродействующих антидепрессантов.

Заявление о доступности данных

Наборы данных, созданные для этого исследования, доступны по запросу соответствующему автору.

Вклад авторов

KB, AK, AS, PB, IB, TC, AM, SG, CK и JM: проведены эксперименты. KB, AK, AS, AM, AN, JJ, EL, BC, JM и HL: анализ.BC, JM, LL и HL: направление исследований. ЕС и ЛТ: конструкции. AN, BC, KB, EL, LL и HL: подготовка и проверка рукописи. LL, KB и HL: финансирование.

Финансирование

Это исследование было поддержано грантами Национальных институтов здравоохранения США (GM123582, Mh220823, DA046122, NS0, NS013522, Mh207056), Калифорнийского института регенеративной медицины (EDUC2-08398), Фонда исследований мозга и поведения (NARSAD), Фонд Делла Мартина, Медицинский институт Говарда Хьюза, программа Калифорнийского технологического института CI 2 , доноры Калифорнийского технологического института SURF Дэвид и Карен Россум и Фонд Омелы.

Конфликт интересов

LT — основатель Seven Biosciences.

Остальные авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Джейкоб П. Келлер: советы по pH и трубкам. Лаура Любберт: помогите с экспериментами. Люк Л. Лавис: синтез N,N-диметил-S-кетамина. Майкл Махер: советы по кетамину. Аниндья Бхаттачарья: советы по кетамину.Даниэль Вагенаар: создание светодиодных источников света. Лорен М. Барнетт: советы по фотохимии. Эрик Р. Шрайтер: биосенсоры. Джонатан Ван: техническая помощь. Маргарет Джеффрис и Пурнима Дешпанде: отличное руководство лабораторией Джанелии и Калифорнийского технологического института.

Сноски

  1. www.attc.org
  2. https://fujifilmcdi.com
  3. https://www.stemcell.com
  4. https://www.mattek.com

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fncel.2019.00499/full#supplementary-material.

Ссылки

Адайккан, К., Таха, Э., Баррера, И., Дэвид, О., и Розенблюм, К. (2018). Кальций/кальмодулинзависимая протеинкиназа II и пути киназы эукариотического фактора элонгации 2 опосредуют антидепрессивное действие кетамина. биол. Психиатрия 84, 65–75. doi: 10.1016/j.biopsych.2017.11.028

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Отри, А.Э., Адачи М., Носырева Э., На Э. С., Лос М. Ф., Ченг П. Ф. и др. (2011). Блокада рецепторов NMDA в состоянии покоя вызывает быстрые поведенческие антидепрессивные реакции. Природа 475, 91–95. doi: 10.1038/nature10130

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Барнетт, Л. М., Хьюз, Т. Е., и Дробижев, М. (2017). Расшифровка молекулярного механизма, ответственного за Ca2+-зависимое изменение флуоресценции GCaMP6m. PLoS One 12:e0170934.doi: 10.1371/journal.pone.0170934

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Берман, Р. М., Каппиелло, А., Ананд, А., Орен, Д. А., Хенингер, Г. Р., Чарни, Д. С., и соавт. (2000). Антидепрессивные эффекты кетамина у пациентов с депрессией. биол. Психиатрия 47, 351–354. doi: 10.1016/s0006-3223(99)00230-9

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Берел, Э., Сонг, Л., и Джоуп, Р. С. (2011). Ингибирование киназы-3 гликогенсинтазы необходимо для быстрого антидепрессивного эффекта кетамина у мышей. Мол. Психиатрия 16, 1068–1070. doi: 10.1038/mp.2011.47

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Бик, М.Дж., Грейзен, П.Дж., Мори, К.Дж., Антунес, М.С., Ла, Д., Санкаран, Б., и соавт. (2017). Вычислительный дизайн датчиков окружающей среды для сильнодействующего опиоида фентанила. Элиф 6:e28909. doi: 10.7554/elife.28909

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Бланпиед, Т. А., Бекман, Ф. А., Айзенман, Э.и Джонсон, Дж. В. (1997). Блокирование каналов захвата NMDA-активируемых ответов амантадином и мемантином. Дж. Нейрофизиол. 77, 309–323. doi: 10.1152/jn.1997.77.1.309

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чен, X., Шу, С., и Бейлисс, Д. А. (2009). Субъединицы канала HCN1 являются молекулярным субстратом для снотворного действия кетамина. J. Neurosci. 29, 600–609. doi: 10.1523/JNEUROSCI.3481-08.2009

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Коутс, К.М. и Флад, П. (2001). Кетамин и его консервант, хлорид бензетония, ингибируют рекомбинантные нейрональные никотиновые ацетилхолиновые рецепторы α7 и α4β2 человека в ооцитах Xenopus. Бр. Дж. Фармакол. 134, 871–879. doi: 10.1038/sj.bjp.0704315

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

de Duve, C., de Barsy, T., Poole, B., Trouet, A., Tulkens, P., and Van Hoof, F. (1974). Комментарий. Лизосомотропные средства. Биохим. Фармакол. 23, 2495–2531.дои: 10.1016/0006-2952(74)

-9

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Дин, К., Хан, Ю., Сейд, Т.В., Бузер, К., Кариго, Т., Чжан, С., и др. (2019). Визуализация высвобождения нейропептидов в синапсах с помощью генетически модифицированного репортера. Элиф 8:e46421. doi: 10.7554/elife.46421

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Emnett, C., Li, H., Jiang, X., Benz, A., Boggiano, J., Conyers, S., et al. (2016).Кликабельный аналог кетамина сохраняет активность рецептора NMDA, психоактивность и накапливается в нейронах. науч. Респ. 6:38808. дои: 10.1038/srep38808

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Эмнетт, К.М., Эйзенман, Л.Н., Тейлор, А.М., Изуми, Ю., Зорумски, К.Ф., и Меннерик, С. (2013). Неразличимая синаптическая фармакодинамика блокаторов каналов N-метил-D-аспартатных рецепторов мемантина и кетамина. Мол. Фармакол. 84, 935–947.doi: 10.1124/моль.113.089334

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Гидеонс, Э.С., Кавалали, Э.Т., и Монтеджиа, Л.М. (2014). Механизмы, лежащие в основе дифференциальной эффективности мемантина и кетамина при быстрой реакции на антидепрессанты. Проц. Натл. акад. науч. США 111, 8649–8654. doi: 10.1073/pnas.13231

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хашимото, К. (2019). Быстродействующий антидепрессант кетамин, его метаболиты и другие кандидаты: исторический обзор и перспективы на будущее. Психиатрическая клиника. Неврологи. 73, 613–627. doi: 10.1111/pcn.12902

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Джонсон, Дж. В., Глазго, Н. Г., и Повышева, Н. В. (2015). Недавнее понимание механизма действия мемантина и кетамина. Курс. мнение Фармакол. 20, 54–63. doi: 10.1016/j.coph.2014.11.006

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Капур, С., и Симан, П. (2001). Кетамин имеет одинаковое сродство к рецепторам NMDA и высокоаффинное состояние дофаминового рецептора D2. биол. Психиатрия 49, 954–957. doi: 10.1016/s0006-3223(01)01110-6

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Капур, С., и Симан, П. (2002). Антагонисты рецепторов NMDA кетамин и PCP оказывают прямое воздействие на рецепторы допамина D 2 и серотонина 5-HT 2 — последствия для моделей шизофрении. Мол. Психиатрия 7, 837–844. doi: 10.1038/sj.mp.4001093

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Килле, С., Acevedo-Rocha, C.G., Parra, L.P., Zhang, Z.G., Opperman, D.J., Reetz, M.T., et al. (2013). Уменьшение избыточности кодонов и усилия по скринингу комбинаторных белковых библиотек, созданных путем мутагенеза с насыщением. Синтезатор ACS. биол. 2, 83–92. дои: 10.1021/sb300037w

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Lee, R.H., Tseng, T.Y., Wu, C.Y., Chen, P.Y., Chen, M.F., Kuo, J.S., et al. (2012). Мемантин ингибирует опосредованную α3β2-nAChR нитрергическую нейрогенную вазодилатацию в базилярных артериях свиней. PLoS One 7:e40326. doi: 10.1371/journal.pone.0040326

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лепак, А. Э., Фучиками, М., Дуайер, Дж. М., Банаср, М., и Думан, Р. С. (2014). Высвобождение BDNF необходимо для поведенческих действий кетамина. Междунар. J. Нейропсихофармакол. 18:pyu033. дои: 10.1093/ijnp/pyu033

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лестер, Х. А., Мива, Дж. М., и Шринивасан, Р.(2012). Психиатрические препараты связываются с классическими мишенями в рамках ранних путей экзоцитоза: терапевтические эффекты. биол. Психиатрия 72, 905–915. doi: 10.1016/j.biopsych.2012.05.020

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лю, Р. Дж., Фучиками, М., Дуайер, Дж. М., Лепак, А. Э., Думан, Р. С., и Агаджанян, Г. К. (2013). Ингибирование GSK-3 потенцирует синаптогенные и антидепрессантоподобные эффекты подпороговых доз кетамина. Нейропсихофармакология 38, 2268–2277.doi: 10.1038/npp.2013.128

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

MacDonald, J.F., Bartlett, M.C., Mody, I., Pahapill, P., Reynolds, J.N., Salter, M.W., et al. (1991). Действие кетамина, фенциклидина и МК-801 на токи рецепторов NMDA в культивируемых нейронах гиппокампа мыши. Журнал физиол. 432, 483–508. doi: 10.1113/jphysiol.1991.sp018396

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Марвин, Дж. С., Borghuis, B.G., Tian, ​​L., Cichon, J., Harnett, M.T., Akerboom, J., et al. (2013). Оптимизированный флуоресцентный зонд для визуализации нейротрансмиссии глутамата. Нац. Методы 10, 162–170. doi: 10.1038/nmeth.2333

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Миллер, О.Х., Ян, Л., Ван, С.С., Харгродер, Э.А., Чжан, Ю., Делпир, Э., и соавт. (2014). Рецепторы NMDA, содержащие GluN2B, регулируют поведение, подобное депрессии, и имеют решающее значение для быстрого антидепрессивного действия кетамина. Элиф 3:e03581. doi: 10.7554/eLife.03581

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Моаддел Р., Абдрахманова Г., Козак Дж., Йозвяк К., Толл Л., Хименес Л. и соавт. (2013). Субанестезирующие концентрации метаболитов (R,S)-кетамина ингибируют вызванные ацетилхолином токи в никотиновых ацетилхолиновых рецепторах α7. евро. Дж. Фармакол. 698, 228–234. doi: 10.1016/j.ejphar.2012.11.023

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пантойя, Р., Родригес, Э.А., Дибас, М.И., Догерти, Д.А., и Лестер, Х.А. (2009). Визуализация одной молекулы флуоресцентной аминокислоты необычного происхождения, встроенной в никотиновые рецепторы. Биофиз. J. 96, 226–237. doi: 10.1016/j.bpj.2008.09.034

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Прескорн С. Х., Бейкер Б., Коллури С., Меннити Ф. С., Крамс М. и Ланден Дж. В. (2008). Инновационный дизайн для доказательства концепции антидепрессивных эффектов селективного антагониста N-метил-D-аспартата субъединицы NR2B, CP-101,606, у пациентов с рефрактерным к лечению большим депрессивным расстройством. Дж. Клин. Психофармак. 28, 631–637. doi: 10.1097/JCP.0b013e31818a6cea

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Рен, З., Прибиаг, Х., Джефферсон, С.Дж., Шори, М., Фукс, Т., Стеллваген, Д., и другие. (2016). Двунаправленная гомеостатическая регуляция состояния мозга, связанного с депрессией, за счет дефицита γ-аминомасляной кислоты и лечения кетамином. биол. Психиатрия 80, 457–468. doi: 10.1016/j.biopsych.2016.02.009

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Руден, К.T., Schindelin, J., Hiner, M.C., DeZonia, B.E., Walter, A.E., Arena, E.T., et al. (2017). ImageJ2: ImageJ для следующего поколения данных научных изображений. Биоинформатика BMC 18:529. doi: 10.1186/s12859-017-1934-z

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Шиванге, А.В., Борден, П.М., Мутусами, А.К., Николс, А.Л., Бера, К., Бао, Х., и соавт. (2019). Определение фармакокинетики никотиновых препаратов в эндоплазматическом ретикулуме с помощью биосенсоров. J. Gen. Physiol. 151, 738–757. doi: 10.1085/jgp.201812201

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Смит, Д., Аллертон, К., Калгуткар, А., ван де Ватербимд, Х., и Уокер, Д. (2012). Фармакокинетика и метаболизм при разработке лекарств. Вайнхайм: Wiley VCH.

Сринивасан, Р., Хенли, Б.М., Хендерсон, Б.Дж., Индерсмиттен, Т., Коэн, Б.Н., Ким, С.Х., и соавт. (2016). Концентрация никотина, связанная с курением, ослабляет реакцию развернутого белка в дофаминергических нейронах. J. Neurosci. 36, 65–79. doi: 10.1523/JNEUROSCI.2126-15.2016

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сринивасан Р., Пантоха Р., Мосс Ф.Дж., Макки Э.Д.В., Сон С., Мива Дж. и соавт. (2011). Никотин активирует никотиновые рецепторы α4β2 и сайты выхода ER посредством зависимого от стехиометрии сопровождения. J. Gen. Physiol. 137, 59–79. doi: 10.1085/jgp.201010532

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Стеновец, М., Божич М., Пирнат С. и Зорец Р. (2019). Астроглиальные механизмы действия кетамина включают снижение подвижности везикул, несущих Kir4.1. Нейрохим. Рез. doi: 10.1007/s11064-019-02744-1

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вс, Т.-П. (2019). Неканонические мишени, опосредующие действие наркотических средств: кокаин на рецепторе сигма-1 в качестве примера. Фронт. Неврологи. 13:761. doi: 10.3389/fnins.2019.00761

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Тишбирек, К.H., Wenzel, E.M., Zheng, F., Huth, T., Amato, D., Trapp, S., et al. (2012). Зависимое от использования торможение синаптической передачи секрецией внутривезикулярных антипсихотических препаратов. Нейрон 74, 830–844. doi: 10.1016/j.neuron.2012.04.019

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Трапп, С., Розания, Г. Р., Хоробин, Р. В., и Корнхубер, Дж. (2008). Количественное моделирование селективного нацеливания на лизосомы для разработки лекарств. евро.Биофиз. J. 37, 1317–1328. doi: 10.1007/s00249-008-0338-4

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Такер, К.Р., Блок, Э.Р., и Левитан, Э.С. (2015). Потенциалы действия и амфетамин высвобождают антипсихотическое лекарство из синаптических пузырьков VMAT дофаминовых нейронов. Проц. Натл. акад. науч. США 112, E4485–E4494. doi: 10.1073/pnas.1503766112

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Видман, А. Дж., и МакМахон, Л.Л. (2018). Растормаживание пирамидных клеток СА1 низкими дозами кетамина и других антагонистов с быстрой антидепрессивной эффективностью. Проц. Натл. акад. науч. США 115, E3007–E3016. doi: 10.1073/pnas.1718883115

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Wohleb, E.S., Wu, M., Gerhard, D.M., Taylor, S.R., Picciotto, M.R., Alreja, M., et al. (2016). Интернейроны ГАМК опосредуют быстрое антидепрессантоподобное действие скополамина. Дж. Клин. Вкладывать деньги. 126, 2482–2494. дои: 10.1172/jci85033

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Рэй, Н. Х., Шаппи, Дж. М., Сингх, Х., Сенезе, Н. Б., и Расеник, М. М. (2018). NMDAR-независимое, цАМФ-зависимое антидепрессивное действие кетамина. Мол. Психиатрия doi: 10.1038/s41380-018-0083-8

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ямакура, Т., Чавес-Норьега, Л.Е., и Харрис, Р.А. (2000). Субъединичное ингибирование никотиновых ацетилхолиновых рецепторов нейронов человека и других лиганд-управляемых ионных каналов диссоциативными анестетиками кетамином и дизоцилпином. Анестезиология 92, 1144–1153. дои: 10.1097/00000542-200004000-00033

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Yang, Y., Cui, Y., Sang, K., Dong, Y., Ni, Z., Ma, S., et al. (2018). Кетамин блокирует разрывы в латеральной уздечке, быстро уменьшая депрессию. Природа 554, 317–322. doi: 10.1038/nature25509

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Занос, П., Моаддел, Р.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.