Пцр коклюш инвитро: Инвитро. Коклюш, узнать цены на анализы и сдать в Москве

Посев на бордетеллы коклюша/паракоклюша (Bordetella pertussis/parapertussis)

Метод определения Бактериологический, бактериоскопический

Исследуемый материал Смотрите в описании

Доступен выезд на дом

Бактериологическое подтверждение клинического диагноза коклюша.

Коклюш — острое инфекционное заболевание, вызываемое грамотрицательным микробом – Bordetella pertussis. Инкубационный период продолжается от двух до 14 дней (чаще от 5 до 7 дней). Начало заболевания проявляется общим недомоганием, насморком, небольшим кашлем, субфебрильной температурой.

Постепенно кашель усиливается и начинается период судорожного кашля. Приступ заканчивается выделением вязкой мокроты, иногда рвотой.

Таких приступов может быть до 50 в сутки. Наиболее частым осложнением является пневмония; может обостриться туберкулёз.

Достоверный диагноз в катаральном периоде может быть поставлен только с помощью бактериологического исследования. Оно показано, если был контакт с больными коклюшем и отсутствуют данные о прививках. В периоде спазматического кашля диагноз основывается на типичных приступах. Но приступы кашля, сходные с коклюшными, могут быть и при аденовирусной инфекции, сдавлении дыхательных путей опухолью, инфекционном мононуклеозе.

Диагноз подтверждается выделением возбудителя коклюша.

Материал для исследования: слизь с задней стенки глотки (материал берётся через рот с помощью заднеглоточного тампона) или через нижние носовые ходы (материал берётся через нос с помощью назофарингеального тампона, эта техника используется чаще зарубежом). У грудных детей материал берут с помощью заднеглоточного тампона.

Паракоклюш – острое инфекционное заболевание вызываемое грамотрицательным микробом Bordetella parapertussis, сходное по инкубационному периоду и клиническим проявлениями с коклюшем, но с менее выраженными симптомами.

Антитела класса IgA к Bordetella pertussis

Интерпретация результатов

Интерпретация результатов исследований содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.

Единицы измерения в лаборатории ИНВИТРО: тест качественный.

Результаты выдаются в терминах «положительно», «отрицательно», «сомнительно».

Положительно: текущая или недавняя инфекция Bordetella pertussis.

Отрицательно:

  1. отсутствие текущей или недавней инфекции Bordetella pertussis;
  2. очень низкое содержание или отсутствие IgA антител в крови во время инфекции Bordetella pertussis.

Сомнительно: результат находится в «серой зоне» +/- 10% от значения порога. В случае получения результата «сомнительно» рекомендовано повторить исследование со взятием крови через 2 – 4 недели, при этом повторно сомнительный результат трактуют как отрицательный.

  1. низкое содержание IgA антител;
  2. неспецифический результат.

Исследование имеет ограниченную ценность у новорожденных и лиц с иммунодефицитом.

При положительном результате выдается значение коэффициента позитивности.* 

* Коэффициент позитивности (КП) – это отношение оптической плотности пробы пациента к пороговому значению. КП – коэффициент позитивности является универсальным показателем, применяемым в качественных иммуноферментных тестах. КП характеризует степень позитивности исследуемой пробы и может быть полезен врачу для правильной интерпретации полученного результата. Поскольку коэффициент позитивности не коррелирует линейно с концентрацией антител в пробе, не рекомендуется использовать КП для динамического наблюдения за пациентами, в том числе контроля эффективности лечения.

Антитела класса IgG Bordetella pertussis

Метод определения Иммуноанализ.

Исследуемый материал Сыворотка крови

Доступен выезд на дом

Онлайн-регистрация

Коклюш – распространённое инфекционное заболевание, несмотря на повсеместную вакцинацию. Возбудитель коклюша Bordetella pertussis прикрепляется к мерцательному эпителию дыхательных путей и вырабатывает токсины, которые подавляют активность ресничек эпителия, вызывают местное воспаление и нарушают очищение бронхов.

Инкубационный период инфекции обычно составляет 5 – 10 суток (иногда до 3 недель). Это длительное заболевание, в котором выделяют 3 периода: катаральный (неотличимый от обычной простуды), период спазматического кашля и период выздоровления. Возможно развитие острых и хронических осложнений, как инфекционных, так и неинфекционных. Большинство из них развивается в период спазматического кашля, который длится от 1 до 6 недель. Заразность в этот период снижается, но некоторые больные продолжают выделять возбудителя в течение 3 недель от начала кашля. В типичных случаях диагноз ставят по клинической картине, у людей, не имеющих иммунитета, классические проявления коклюша трудно спутать с другим заболеванием. У иммунных лиц симптомы не столь типичны.

Эталонный метод лабораторной диагностики – посев отделяемого носоглотки в первые 2 – 3 недели болезни; в более поздние сроки ценность исследования снижается. В клиническом анализе крови наблюдается лимфоцитоз (абсолютное количество лимфоцитов более 10 000/мкл свидетельствует о системном действии коклюшного токсина). Использование серологического тестирования (антитела к антигенам клеток Bordetella pertussis и Bordetella pertussis токсину) целесообразно на более поздних стадиях инфекции, оно имеет высокую специфичность, но относительно низкую чувствительность. Для подтверждения диагноза возможно использование молекулярно-генетического (ПЦР) тестирования.

Тест направлен на выявление антител класса IgG к антигенам клеток Bordetella pertussis и к токсину Bordetella pertussis. Иммуноглобулины класса IgG появляются в ходе иммунного ответа на возбудителя инфекции и его токсины вслед за IgM, эти антитела сохраняются наиболее длительный срок по сравнению с остальными, свидетельствуя о наличии иммунитета. Концентрацию IgG к B. pertussis и B. pertussis токсину трудно соотнести с напряжённостью иммунитета, сведений по пороговому уровню IgG, необходимому для обеспечения протективного иммунитета, нет. В отличие от антител класса IgA, антитела классов IgG и IgM появляются как в ходе естественной инфекции, так и после вакцинации. Диагностическая чувствительность теста – 66,6%. Диагностическая специфичность – 100%. 

У людей с иммунодефицитом и новорожденных серологическое тестирование имеет ограниченное значение.

Дифференцированное определение ДНК возбудителей коклюша (Bordetella pertussis), паракоклюша (Bordetella parapertussis) и бронхисептикоза (Bordetella bronchiseptica) в мазке слизистой носоглотки и ротоглотки (смешанный мазок).

Метод определения ПЦР с детекцией в режиме реального времени.

Исследуемый материал Смешанный мазок из носоглотки и мазок из зева (ротоглотки)

Тест предназначен для раздельного определения ДНК возбудителей коклюша (Bordetella pertussis), паракоклюша (Bordetella parapertussis) и бронхисептикоза (Bordetella bronchiseptica) в мазке слизистой носоглотки или ротоглотки.

Бактерия Bordetella pertussis является возбудителем коклюша – острого антропонозного инфекционного заболевания с воздушно-капельным механизмом передачи. Заболевание характеризуется специфичным спазматическим кашлем, поражением дыхательной, сердечно-сосудистой и нервной систем. 

Инкубационный период инфекции обычно составляет 5-10 суток (иногда до трех недель), пациент заразен с 1-го до 25-го дня болезни. Коклюш – длительное заболевание, в котором выделяют три периода: катаральный, неотличимый по симптоматике от обычной простуды (3-14 суток), период спазматического кашля (от 2-3 недель до 6-8 недель и более) и период выздоровления, который в свою очередь разделен на период обратного развития, или ранней реконвалесценции (2-8 недель) и период поздней реконвалесценции (2-6 месяцев). В результате этой болезни возможно развитие острых и хронических осложнений, как инфекционных, так и неинфекционных. Большинство из них возникает в периоде спазматического кашля, когда заразность снижается, но некоторые больные продолжают выделять возбудителя в течение трех недель от начала кашля. 

В типичных случаях диагноз ставят по клинической картине, у людей, не имеющих иммунитета, классические проявления коклюша трудно перепутать с другим заболеванием. У иммунных лиц симптомы не столь типичны. 

Несмотря на то, что коклюш до сих пор считается детской инфекцией, в возрастной структуре заболевших в последние годы преобладают подростки и взрослые с атипичной формой заболевания. Данные популяционные группы в настоящее время являются главным источником вспышек заболевания и заражения невакцинированных лиц. Это особенно опасно в семьях с грудными детьми, у которых коклюш протекает очень тяжело и представляет прямую угрозу для жизни. 

Bordetella pertussis относится к роду Bordetella, который включает в себя и другие виды микроорганизмов, имеющих клиническую значимость для человека: Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica. 

Все представители рода Bordetella являются респираторными патогенами за счет своей тропности к эпителиальным реснитчатым клеткам. 

Bordetella parapertussis вызывает паракоклюш. Заболевание по клиническим проявлениям напоминает коклюш, но характеризуется более легким течением. 

Bordetella bronchiseptica вызывает бронхисептикоз (бордетеллез) и является для человека оппортунистическим патогеном при респираторных (бронхит, пневмония) и других инфекциях (бактериемия, инфекции ран, эндокардит, менингит, перитонит). Бронхисептикоз может развиваться после контакта с инфицированными животными. 

Для лабораторной диагностики коклюша и паракоклюша применяют микробиологический метод – посев отделяемого носоглотки (см. тест № 470 Посев на бордетеллы коклюша/паракоклюша) в первые 2-3 недели болезни. В более поздние сроки ценность исследования снижается.  Серологическая диагностика позволяет определить специфические иммуноглобулины классов IgA, IgM, IgG (см. тесты №№ 245, 246 и 247). Обнаружение IgA и IgM-антител свидетельствует о недавней инфекции и используется для дифференциальной диагностики. IgG-антитела начинают определяться у больных на 2-3-й неделе от начала болезни, а также могут выявляться у вакцинированных и ранее переболевших лиц. 

В настоящее время быстрым высокочувствительным и специфичным методом обнаружения бактерий рода Bordetella является метод ПЦР. Чувствительность и специфичность метода достигает 100%. Метод диагностики ПЦР можно применять на фоне приема антибактериальных препаратов, у лиц, вакцинированных или переболевших, для определения возможного бактерионосительства. 

Исследование позволяет дифференцировать коклюш от паракоклюша и бронхисептикоза, что имеет важное значение в ведении больных и тактики лечения.

Антитела класса IgM к Bordetella pertussis

Метод определения Иммуноанализ.

Исследуемый материал Сыворотка крови

Доступен выезд на дом

Онлайн-регистрация

Маркёр первичной инфекции или недавней вакцинации Bordetella pertussis.

Коклюш – распространённое инфекционное заболевание, несмотря на повсеместную вакцинацию. Возбудитель коклюша Bordetella pertussis прикрепляется к мерцательному эпителию дыхательных путей и вырабатывает токсины, которые подавляют активность ресничек эпителия, вызывают местное воспаление и нарушают очищение бронхов.

Инкубационный период инфекции обычно составляет 5 – 10 суток (иногда до 3 недель). Это длительное заболевание, в котором выделяют 3 периода: катаральный (неотличимый от обычной простуды), период спазматического кашля и период выздоровления. Возможно развитие острых и хронических осложнений, как инфекционных, так и неинфекционных. Большинство из них развивается в период спазматического кашля, который длится от 1 до 6 недель. Заразность в этот период снижается, но некоторые больные продолжают выделять возбудителя в течение 3 недель от начала кашля. В типичных случаях диагноз ставят по клинической картине, у людей, не имеющих иммунитета, классические проявления коклюша трудно спутать с другим заболеванием. У иммунных лиц симптомы не столь типичны.

Эталонный метод лабораторной диагностики – посев отделяемого носоглотки в первые 2 – 3 недели болезни; в более поздние сроки ценность исследования снижается. В клиническом анализе крови наблюдается лимфоцитоз (абсолютное количество лимфоцитов более 10 000/мкл свидетельствует о системном действии коклюшного токсина). Использование серологического тестирования (антитела к антигенам клеток Bordetella pertussis и Bordetella pertussis токсину) целесообразно на более поздних стадиях инфекции, оно имеет высокую специфичность, но относительно низкую чувствительность. 

Для подтверждения диагноза возможно использование молекулярно-генетического (ПЦР) тестирования.

Сдать анализ крови на коклюш и паракоклюш в СПб, ИНВИТРО: Цена исследования и диагностики, Срочно


Антитела класса IgA к Bordetella pertussis (коклюш)

Срок исполнения: 1 рабочий день


Aнтитела класса IgG к Bordetella pertussis (коклюш)

Срок исполнения: 1 рабочий день


Антитела класса IgM к Bordetella pertussis (коклюш)

Срок исполнения: 1 рабочий день


Посев отделяемого ротоглотки на бордетеллы

Срок исполнения: 1 рабочий день


Коклюш – острое заболевание инфекционной природы, сопровождающееся воспалительными процессами в гортани, трахеях, носоглотке. Возбудителем болезни становится Bordetella pertussis. Эта бактерия попадает в организм воздушно-капельным путем (во время чихания, кашля, выделений из носа), а также при использовании одной посуды, белья, средств гигиены с инфицированным человеком. Диагностируют коклюш путем проведения лабораторных анализов.

Методы лабораторной диагностики коклюша

Преимущественно коклюш – детское заболевание. Однако сегодня эта патология достаточно часто встречается и у взрослых. Возбудитель провоцирует развитие воспалительного процесса и спазматический кашель. В клинической практике применяется несколько типов лабораторной диагностики коклюша. Так, наличие Bordetella pertussis могут подтвердить такие методы диагностики:

  • Биологический способ – предполагает бактериологический посев биоматериала из носоглотки. Биологический материал – мокрота, слизь и другое отделяемое из верхних дыхательных путей. Мазок из ротоглотки берется два дня подряд. Биоматериал исследуется на состав микрофлоры. Отделяемое высаживают на питательную почву и наблюдают за ростом колоний бактерий в течение 3-7 дней. Далее выросшие колонии исследуются под микроскопом на наличие Bordetella. Этот тип исследования проводится в начале развития заболевания (3-7 день), а его информативность составляет 20-90%.
  • Анализ крови – проводится в рамках комплексной диагностики коклюша. В качестве самостоятельного анализ на коклюш имеет низкую информативность, поскольку демонстрирует только наличие воспалительных процессов в организме. При поражении Bordetella увеличивается количество лимфоцитов, лейкоцитов, а другие показатели остаются в пределах нормы.
  • Метод ИФА – исследование крови на наличие антител к Bordetella. Биоматериал – сыворотка, которая лабораторным способом выделяется из венозной крови пациента. Метод применяют на второй-третьей недели течения болезни, а его информативность составляет около 70%. Исследование направлено на выделение нескольких типов иммуноглобулинов – антитела классов IgA, IgG и IgM. Анализируются качественные (позитивный/отрицательный тест) и количественные (титры) критерии.
  • ПЦР-диагностика – предполагает исследование биологического материала на наличие ДНК возбудителя коклюша. Забор биоматериала проводится в носоглотке в виде мазка. Если специфические ДНК Bordetella найдены, диагностируется коклюш. Причем информативность этого метода составляет 100%.

Подготовка к сдаче анализа

Вне зависимости от типа биоматериала, забор производится всегда натощак. После употребления жидкости также должно пройти 2-3 часа. Если диагностика проводится на основании исследования венозной крови, то необходимо соблюдать такие рекомендации:

  • перед сдачей крови в течение 15-20 минут находиться в состоянии физического покоя;
  • за 10-12 часов отказаться от приема спиртного, табака, пищи, минимизировать физические нагрузки;
  • за 12 часов до сдачи биоматериала следует прекратить прием лекарственных препаратов;
  • ребенку до 5 лет нужно соблюдать питьевой режим за полчаса до забора крови – выпить 200 мл воды за 30 минут маленькими порциями.

Как проходит анализ на коклюш в клинике «Радуга»?

В комфортной и спокойной обстановке опытные медработники произведут забор венозной крови и мазок из ротоглотки. Биологический материал аккуратно и тщательно упаковывается в отдельные пробирки и контейнеры с указанием личных данных пациента. Готовый биоматериал отправляют в диагностическую лабораторию с соблюдением всех требований. Результаты приходят в клинику через несколько дней (в зависимости от метода исследования).

Стоимость

Выгодные цены на услугу “Коклюш” представлены в медицинском центре Радуга, расположенном в Санкт-Петербурге. Опытные врачи центра ставят своей первоочередной задачей восстановление здоровья пациента без назначения лишних процедур, увеличивающих расходы на лечение. Мы предлагаем доступную стоимость на квалифицированную медицинскую помощь.

После забора крови проверяется общее состояние пациента на предмет головокружений, слабости, тошноты. При необходимости медработники измеряют артериальное давление и предлагают лекарственные препараты для нормализации состояния. В клинике «Радуга» позаботятся о вашем здоровье с помощью современных методов диагностики заболеваний. Мы приглашаем сдавать анализы удобно, комфортно и эффективно!

Можно доверять! Данная статья проверена врачом и носит общий информационный характер, не заменяет консультацию специалиста. Для рекомендаций по диагностике и лечению необходима консультация врача.

Уролог-андролог, врач высшей категории

Стаж: 20 лет

Вакцинация детей и взрослых, вакцины нового поколения – сеть клиник МЕДСИ

Вакцинация в клиниках МЕДСИ проводится под контролем квалифицированного специалиста в соответствии с Национальным календарем прививок. Кроме того, осуществляется вакцинация против некоторых инфекций, не входящих в список обязательных прививок, в том числе от гепатита А, вируса папилломы человека, клещевого энцефалита, ротавирусной инфекции, менингококковой инфекции, ветряной оспы.

В клиниках используются только качественные отечественные и импортные вакцины. Специалисты МЕДСИ пристально следят за тенденциями фармацевтического рынка и оперативно приобретают в арсенал клиник вакцины нового поколения, то есть более эффективные и безопасные.

Вакцинация проводится в клиниках МЕДСИ по предварительной записи на удобное для вас время при наличии вакцины и после осмотра врача. Записаться на приём и уточнить информацию о наличии нужной Вам вакцины в клиниках «МЕДСИ» можно по телефону круглосуточного контактного центра +7 ((495) 023-60-84.

Ежегодная вакцинации против гриппа – защита взрослых и детей

Грипп – острая инфекция, вызывающая ежегодные эпидемии. Протекает с высокой температурой в течение 3-5 дней, с резкой интоксикацией в виде головной боли, болей в мышцах. Грипп обостряет хронические воспалительные процессы в организме, тем самым обусловливая высокую летальность от осложнений.

Возбудители – пневмотропные РНК-содержащие вирусы 3-х серотипов (А,В,С).

Распространение гриппа в наше время в значительной степени связано с быстротой перемещения населения.

Вакцинация – наиболее эффективный метод снижения заболеваемости не только гриппом, но и ОРЗ, вызванных другими респираторными вирусами, как среди взрослых, так и среди детей, в том числе больных бронхиальной астмой и респираторными аллергозами.

Иммунитет вырабатывается через 14 дней после вакцинации.

Постоянная мутация штаммов вируса гриппа, а также непродолжительность поствакцинального периода (6-12 месяцев) требуют ежегодного повторения прививок, даже если ее штаммовый состав, по сравнению с предыдущим сезоном, не изменился. При заражении штаммами гриппозного вируса, отличающимся от вакцинных, заболевание у вакцинированных протекает легче. Живые вакцины слабореактогенны, температура выше 37, 5 в первые 3 дня допускается не более чем у 2% привитых. Субъединичные вакцины дают слабые кратковременные (48-72 часа) реакции не более чем у 3%. Наименее реактогенными по данным международных независимых исследований являются субъединичные вакцины.

Противопоказания для всех вакцин – аллергия к белкам куриного яйца, аллергические реакции на введение любой гриппозной вакцины. Все гриппозные вакцины готовятся из актуальных штаммов вирусов А/h2N1, A/h4N2, В, рекомендуемых ежегодно BОЗ.

Дифференциальная экспрессия гена brkA in vitro в клинических изолятах Bordetella pertussis и Bordetella parapertussis

J Clin Microbiol. 2006 сен; 44 (9): 3397–3400.

Паола Стефанелли

Отделение инфекционных, паразитарных и иммуно-опосредованных болезней, Istituto Superiore di Sanità, Рим, Италия, 1 Институт микробиологии, Università Cattolica del Sacro Cuore, Рим, Италия

Отделение инфекционных, паразитарных и иммуно-опосредованных заболеваний, Istituto Superiore di Sanità, Рим, Италия, 1 Институт микробиологии, Università Cattolica del Sacro Cuore, Рим, Италия 2

Cecilia Fazio Департамент

Паразитарные и иммуно-опосредованные заболевания, Istituto Superiore di Sanità, Рим, Италия, 1 Институт микробиологии, Università Cattolica del Sacro Cuore, Рим, Италия 2

Brunella Posteraro

Департамент инфекционных и паразитарных заболеваний Diseases, Istituto Superiore di Sanità, Рим, Италия, 1 Институт микробиологии, Università Cattolica d el Sacro Cuore, Рим, Италия 2

Джованни Фадда

Департамент инфекционных, паразитарных и иммуно-опосредованных заболеваний, Istituto Superiore di Sanità, Рим, Италия, 1 Институт микробиологии, Università Catro Cutolica del S , Италия 2

Паола Мастрантонио

Отделение инфекционных, паразитарных и иммуно-опосредованных заболеваний, Istituto Superiore di Sanità, Рим, Италия, 1 Институт микробиологии, Università Cattolica del Sacro , Италия , Италия

Отделение инфекционных, паразитарных и иммунно-опосредованных заболеваний, Istituto Superiore di Sanità, Рим, Италия, 1 Институт микробиологии, Università Cattolica del Sacro Cuore, Рим, Италия 2

* Автор, отвечающий за переписку.Почтовый адрес: Департамент инфекционных, паразитарных и иммуно-опосредованных заболеваний, Istituto Superiore di Sanità, V. le Regina Elena 299, 00161 Rome, Италия. Телефон: 3

5. Факс: 3

387112. Электронная почта: [email protected]

Поступило 3 февраля 2006 г .; Пересмотрено 13 марта 2006 г .; Принято 17 июля 2006 г.

Copyright © 2006, Американское общество микробиологов. Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

В этом исследовании мы настроили ПЦР-анализ обратной транскриптазы в реальном времени для измерения относительного количества транскриптов brkA в 50 изолятах Bordetella .Результаты свидетельствуют о том, что экспрессия brkA зависит от штамма, и ее уровень может играть роль в определении сывороточного фенотипа устойчивости или восприимчивости. Иммунокомпетентные сыворотки против коклюша были неспособны убить Bordetella parapertussis посредством отложения комплемента.

BrkA (антиген, убивающий устойчивость к бордетеллам) считается важным фактором вирулентности Bordetella pertussis из-за его способности опосредовать резистентность в сыворотке крови (1). Ген, кодирующий BrkA, также присутствует у двух видов Bordetella , строго связанных с B.pertussis , а именно B. parapertussis и B. bronchiseptica (5). В частности, B. parapertussis , а также B. pertussis могут вызывать приступы коклюша. Было проведено несколько исследований, которые продемонстрировали перекрестный иммунитет между двумя видами (2), но также была выдвинута гипотеза, что, поскольку оба заражают людей, они разработали механизмы, позволяющие избежать перекрестного иммунитета (6, 11).

Однако есть несколько противоречивых отчетов о способности B.pertussis , чтобы выжить при убийстве комплемента, а также от различных способностей вакцинированных субъектов развивать измеримый бактерицидный иммунный ответ (13-15).

Для измерения экспрессии мРНК brkA в клинических штаммах, принадлежащих к Bordetella spp., 37 штаммам B. pertussis и 13 B. parapertussis штаммам, собранным у младенцев с коклюшем, и одному эталонному штамму, B. pertussis 338, были протестированы с использованием количественного анализа ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР).

ОТ-ПЦР в реальном времени.

Для каждого штамма 5 мл суспензии бульона Stainer Scholte (SS) с концентрацией около 10 9 бактерий на мл (оптическая плотность при 600 нм 0,5), собранных после однократного пассажа с чашек с угольным агаром (CA). в разные моменты времени во время роста использовали для экстракции общей РНК с помощью набора RNeasy Protect Mini, следуя инструкциям производителя (QIAGEN, Hilden, Германия). Экспрессию генов brkA и recA оценивали количественно с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием системы i-Cycler iQ (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния.) (10). Ген домашнего хозяйства recA был использован в качестве эталонного гена, поскольку он не находится под контролем регулона BvgA / S (16). Для каждого гена был разработан набор пар праймеров и зонд Taqman с помощью программного обеспечения Beacon Designer 2 (версия 2.06) (Premier Biosoft International, Пало-Альто, Калифорния) и синтезирован MWG Biotech (Флоренция, Италия) (таблица). Каждую реакцию проводили в четырех повторностях, и эффективность амплификации определяли для всех генов (9). Поскольку ПЦР работали с равной эффективностью, относительные уровни экспрессии мРНК brkA были нормализованы для входной РНК по сравнению с уровнями транскриптов гена recA .Относительные уровни экспрессии мРНК гена brkA в каждом образце рассчитывали с использованием метода сравнительного времени цикла (8). Кроме того, чтобы оценить пригодность recA в качестве эталонного гена для сравнительных исследований экспрессии генов, мы выполнили абсолютную количественную оценку транскриптов recA . Таким образом, стандартная кривая была построена путем построения серийных разведений клонированного фрагмента гена recA (от 10 10 до 10 4 копий на реакцию) и использована для количественного определения мРНК recA в образцах РНК, экстрагированных из B.pertussis 338 клеток, собранных в различные моменты времени (50 нг общей РНК для каждого образца). После определения количества КОЕ для каждого образца результаты выражали как количество транскриптов recA на КОЕ. Сходное количество транскриптов recA было обнаружено в клетках, выращенных в разные моменты времени (1,49 копий / КОЕ через 6 часов, 1,62 копий / КОЕ через 20 часов, 1,70 копий / КОЕ через 24 часа, 1,65 копий / КОЕ через 32 часа. , 1,71 копий / КОЕ через 40 часов и 1,59 копий / КОЕ через 48 часов).Это открытие демонстрирует, что recA экспрессируется на почти идентичных уровнях в клетках B. pertussis , выращенных in vitro в разные моменты времени.

ТАБЛИЦА 1.

Праймеры и флуоресцентные зонды, используемые в ОТ-ПЦР в реальном времени

Сравнение категориальных переменных проводили с использованием одностороннего дисперсионного анализа с посттестом коррекции Даннета. Значение P менее 0,05 считалось статистически значимым.

Анализ убийства сыворотки.

Двадцать семь иммунореактивных образцов сыворотки от детей, выздоравливающих от коклюша или вакцинированных трехкомпонентной бесклеточной коклюшной вакциной, и 20 сывороток от младенцев с кашлем, вызванным B. parapertussis , были использованы после тепловой инактивации в анализе бактерицидной активности сыворотки. , выполняемый в соответствии с уже описанными процедурами (12). В качестве источника комплемента использовали сыворотку Хартли морской свинки (домашний препарат).

Значительные различия ( P <0.05) были обнаружены для 18 штаммов B. pertussis по сравнению с штаммами B. pertussis 338, выбранными в качестве эталонного штамма для экспрессии brkA после 20 часов роста. Из 18 штаммов 8 изолятов показали более низкие уровни экспрессии brkA (от 0,025 до 0,06) и 10 показали более высокие уровни (от 0,18 до 0,38) по сравнению с уровнем в B. pertussis 338 (0,11). Значительно более низкие уровни экспрессии были обнаружены у 5 штаммов B. parapertussis (в диапазоне от 0.045-0,075) из 13 штаммов, проанализированных в отношении как эталонного штамма B. parapertussis 02726, так и B. pertussis 338. Последние два показали одинаковый уровень экспрессии гена. Уровни экспрессии brkA из оставшихся изолятов статистически не отличались от уровня эталонного штамма B. pertussis ( P > 0,05) (данные не показаны).

Профили экспрессии brkA , полученные на протяжении всей фазы роста, разделили изолятов Bordetella на три группы: B.pertussis с низким уровнем транскриптов (рис.), изолятов B. pertussis с высоким уровнем транскриптов (рис.) и изолятов B. parapertussis (рис.). Изоляты B. pertussis с высокими уровнями экспрессии brkA через 20 часов показали более высокую экспрессию гена по всей кривой роста с небольшим увеличением во время поздней фазы роста (между 24 и 32 часами), как показано некоторыми штаммами. Напротив, изолятов B. pertussis с низкими уровнями транскриптов brkA через 20 ч показали сниженную экспрессию на протяжении всего периода роста. Изоляты B. parapertussis продуцировали максимальное количество транскриптов через 20 часов.

Экспрессия гена brkA в различные моменты времени во время роста репрезентативных штаммов Bordetella , как определено анализом ОТ-ПЦР в реальном времени. (A и B) Кинетика экспрессии brkA в репрезентативных изолятах B. pertussis с низким или высоким уровнем транскрипта, соответственно. (C) Кинетика экспрессии brkA в штаммах B. parapertussis .Каждый экстракт тестировали в четырех повторностях для каждой временной точки с помощью RT-PCR. Планки погрешностей показывают стандартные отклонения.

Двадцать семь иммунокомпетентных сывороток (18 сывороток в фазе выздоровления и 9 сывороток после вакцинации) были протестированы отдельно против 18 штаммов B.pertussis со значительно отличающимся уровнем экспрессии brkA по сравнению с эталонным штаммом. На рисунке показаны результаты, выраженные как процент выживаемости бактерий для одного штамма (14782), представляющего штаммы, сильно экспрессирующие ген, для одного изолята (05168), представляющего 8 штаммов, слабо экспрессирующих ген, и для 1 B.parapertussis , представляющий 13 испытанных штаммов. Процент выживаемости B. pertussis 14782 был высоким, 98,4 ± 1,8 и 87 ± 4,9 при использовании сывороток после вакцинации или фазы выздоровления, соответственно. Другие девять штаммов, экспрессирующие высокие уровни экспрессии brkA , показали аналогичные уровни выживаемости в диапазоне от 74 до 100% (данные не показаны) и включали те штаммы, которые имели дополнительное увеличение на brkA во время поздней фазы роста. Подобные высокие проценты выживаемости наблюдались для бактерий с высокими уровнями экспрессии brkA либо через 16 (от 70 до 85%), либо через 40 часов роста (100%) (данные не показаны).столбик относится к 20 сывороткам в фазе выздоровления, полученным от младенцев, выздоравливающих от инфекции B. parapertussis . Результаты представляют собой средние значения (числа над столбиками) и стандартные ошибки (столбцы ошибок) для трех отдельных экспериментов. Bp14782 и Bp05168, представитель B. pertussis с высоким и низким уровнями транскриптов brkA , соответственно; Bpp02726, эталонный штамм B. parapertussis ; Bp338, B. pertussis эталонный штамм 338. Звездочки указывают на статистически значимые различия по сравнению со значением для B.pertussis эталонный штамм 338 ( P <0,05).

Напротив, B. pertussis 05168 был намного более восприимчив к тем же сывороткам после вакцинации или фазы выздоровления с выживаемостью 44% ± 12% и 28% ± 6,7% соответственно. Другие штаммы с низкими уровнями экспрессии brkA показали аналогичный процент выживших колоний. Для штаммов B. parapertussis 02726 и B. parapertussis , включая пять штаммов с низкими уровнями экспрессии brkA , процент выживаемости был высоким для всех сывороток, компетентных в отношении коклюша.бар).

Хотя другие авторы показали, что существует существенная вариация чувствительности сыворотки штамма B. pertussis из-за экспрессии brkA (4), это первое исследование, в котором несколько B. pertussis и B. parapertussis Клинические изоляты исследовали с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени для количественной оценки относительных количеств транскриптов brkA в различные моменты времени во время роста бактерий. Результаты указывают на различия между B.pertussis по уровню экспрессии гена brkA . Более того, наблюдаемые различия в сывороточной чувствительности штаммов хорошо коррелируют с разными уровнями экспрессии гена. Это может указывать на то, что способность способствовать отложению комплемента зависит не только от компетентности сыворотки с точки зрения специфических антител, но также от различных уровней brkA , экспрессируемых бактериями. Результаты бактерицидного анализа с использованием иммунокомпетентных сывороток, собранных после вакцинации или заболевания, согласуются с результатами, уже сообщенными другими авторами: в частности, бесклеточные сыворотки после вакцинации едва ли эффективны в уничтожении бактерий (15).

Кроме того, результаты, полученные в этой работе, подтверждают отсутствие перекрестной реакции бактерицидной активности между B. pertussis и B. parapertussis , даже если относительные уровни транскриптов brkA были аналогичными. Известно, что эти два вида действительно различаются с точки зрения белков, экспонируемых на поверхности, и различный набор выступающих молекул на поверхности может препятствовать эффективной перекрестной иммунной защите (7). Примером является антиген O, присутствующий в B.parapertussis , но отсутствует у B. pertussis и, как известно, ингибирует отложение комплемента (3).

Дальнейшие исследования необходимы для выяснения молекулярных механизмов, участвующих в экспрессии гена brkA на разных уровнях, и для оценки корреляции с уровнями экспрессии белка в клинических изолятах B. pertussis и B. parapertussis .

Благодарности

Это исследование было частично поддержано Соглашением о научном сотрудничестве ISS-NIH (N5303).

Благодарим Тонино Софию за редактирование рукописи.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Barnes, M. G., and A. A. Weiss. 2001. Белок BrkA Bordetella pertussis ингибирует классический путь комплемента после отложения C1. Заразить. Иммун. 69 : 3067-3072. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 2. Бьорнстад, О. Н., и Э. Т. Харвилл. 2005. Эволюция и появление Bordetella у людей. Trends Microbiol. 13 : 355-359.[PubMed] [Google Scholar] 3. Берд, Д. У., Р. М. Руп, Х. П. Фейт и Г. Г. Шуриг. 1991. Чувствительность сыворотки и характеристики липополисахаридов в Bordetella bronchiseptica , B. pertussis и B. parapertussis . J. Med. Microbiol. 34 : 159-165. [PubMed] [Google Scholar] 4. Старейшина, К. Д. и Э. Т. Харвилл. 2004. Штамм-зависимая роль BrkA во время инфекции дыхательных путей мыши Bordetella pertussis .Заразить. Иммун. 72 : 5919-5924. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 5. Fernandez, R.C., and A.A. Weiss. 1994. Клонирование и секвенирование сывороточного локуса резистентности Bordetella pertussis . Заразить. Иммун. 62 : 4727-4738. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 6. Khelef, N., B. Danve, M. J. Quentin-Millet, and N. Guiso. 1993. Bordetella pertussis и Bordetella parapertussis : два иммунологически разных вида.Заразить. Иммун. 61 : 486-490. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 7. Mattoo, S. и J. D. Cherry. 2005. Молекулярный патогенез, эпидемиология и клинические проявления респираторных инфекций, вызываемых Bordetella pertussis и другими подвидами Bordetella . Clin. Microbiol. Ред. 18 : 326-382. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 8. Мейеринк, Дж., К. Мандигерс, Л. ван де Лохт, Э. Тонниссен, Ф. Гудсайд и Дж.Raemaekers. 2001. Новый метод компенсации разной эффективности амплификации между образцами ДНК пациентов в количественной ПЦР в реальном времени. J. Mol. Диаг. 3 : 55-61. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 9. Пирсон, С. Н., Дж. Н. Батлер и Р. Г. Фостер. 2003. Экспериментальная проверка новых и традиционных подходов к количественному анализу данных ПЦР в реальном времени. Nucleic Acids Res. 31 : e73. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 10. Сангинетти, М., Б. Постераро, Б. Фиори, С. Ранно, Р. Торелли и Г. Фадда. 2005. Механизмы устойчивости к азолам в клинических изолятах Candida glabrata , собранных во время обследования устойчивости к противогрибковым препаратам в больницах. Противомикробный. Агенты Chemother. 49 : 668-679. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 11. Ватанабэ М. и М. Нагаи. 2001. Взаимный защитный иммунитет против Bordetella pertussis и Bordetella parapertussis на мышиной модели респираторной инфекции.Заразить. Иммун. 69 : 6981-6986. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 12. Weingart, C. L., W. A. ​​Keitel, K. M. Edwards и A. A. Weiss. 2000. Характеристика бактерицидных иммунных ответов после вакцинации бесклеточными коклюшными вакцинами у взрослых. Заразить. Иммун. 68 : 7175-7179. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 13. Weingart, C. L., and A. A. Weiss. 2000. Bordetella pertussis Факторы вирулентности влияют на фагоцитоз нейтрофилов человека.Заразить. Иммун. 68 : 1735-1739. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 14. Вайс А.А., П.С. Мобберли, Р.С. Фернандес и К.М. Минк. 1999. Характеристика бактерицидных антител человека к Bordetella pertussis . Заразить. Иммун. 67 : 1424-1431. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 15. Вайс, А. А., А. К. Паттон, С. Х. Миллен, С. Дж. Чанг, Дж. И. Уорд и Д. И. Бернштейн. 2004. Бесклеточные коклюшные вакцины и уничтожение комплемента Bordetella pertussis .Заразить. Иммун. 72 : 7346-7351. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 16. Юк, М. Х., Э. Т. Харвилл и Дж. Ф. Миллер. 1998. Система контроля вирулентности BvgAS регулирует секрецию типа III у Bordetella bronchiseptica . Мол. Microbiol. 28 : 945-959. [PubMed] [Google Scholar]

Bordetella pertussis и хронический кашель у взрослых | Клинические инфекционные болезни

Аннотация

Чтобы оценить Bordetella pertussis как причину стойкого кашля у взрослых, мы обследовали 201 пациента, у которых кашель длился 2–12 недель и не было заболевания легких.На презентации мы получили следующее: история болезни, рентгенограмма грудной клетки, измерение функции дыхания, носоглоточный аспират для полимеразной цепной реакции (ПЦР), образец мазка из носоглотки для посева и образец крови (острая сыворотка). Через четыре недели был получен второй образец крови (сыворотка выздоравливающей). Контрольные сыворотки были получены от 164 здоровых доноров крови того же возраста, у которых не было кашля в течение предыдущих 12 недель. У четырех пациентов был положительный посев на B. pertussis ; 11 (включая пациентов с положительной культурой) были B.коклюш ПЦР-положительный; и 33, включая 10 из 11 ПЦР-положительных пациентов, имели серологические доказательства недавней инфекции B. pertussis . Пациентов с положительным и отрицательным исходом коклюша нельзя было различить по кашлю в анамнезе. Мы пришли к выводу, что инфекция B. pertussis является частой причиной стойкого кашля у взрослых. Это вызывает беспокойство, потому что эти пациенты могут быть резервуарами, из которых B. pertussis могут передаваться младенцам, у которых болезнь может иметь разрушительные последствия.

Кашель – основная причина для контакта с терапевтами, на него приходится почти 30 миллионов посещений врачей первичного звена в США в год [1]. Кашель может быть вызван несколькими факторами, в том числе микроорганизмами [1]. Заражение Bordetella pertussis у взрослых с постоянным кашлем [2–6] и у взрослых членов семьи детей с инфекцией B. pertussis [7] было подтверждено серологическими тестами. Диагноз B. pertussis часто основывается на высоких титрах антител в одном образце сыворотки [2–5]; в таких тестах чувствительность и специфичность зависят от выбранных диагностических пороговых значений [3].Кроме того, другие бактерии могут вызывать серологический ответ нитчатых антител к гемагглютинину, имитирующий инфекцию B. pertussis [8, 9]. Следовательно, прямое обнаружение микроорганизма улучшит диагностику инфекции B. pertussis . Культура носоглотки B. pertussis , как известно, нечувствительна, но с введением высокочувствительной ПЦР [10–13] можно будет обнаружить бактерии в носоглоточном секрете у большего числа взрослых с постоянным кашлем.

В этом исследовании мы использовали посев, ПЦР и серологические исследования, чтобы изучить частоту присутствия B. pertussis у взрослых пациентов с продолжительным кашлем.

Материалы и методы

Предметы и выборка . В исследование были включены взрослые пациенты (в возрасте ≥16 лет), направленные в отделение легочной медицины больницы Орхусского университета (Орхус, Дания) по поводу продолжительного кашля в период с ноября 1995 года по май 1997 года.Критериями включения были кашель в течение 2–12 недель, нормальная рентгенограмма грудной клетки, нормальные результаты спирометрии и отсутствие хронических сердечно-легочных заболеваний. Из 247 пациентов, прошедших оценку для включения в исследование, 201 соответствовал критериям включения: 69 мужчин и 132 женщины в возрасте от 16 до 77 лет (среднее ± стандартное отклонение, 41,5 ± 14,1 года). Было исключено 46 пациентов, из которых 15 имели кашель более 12 недель, 19 имели аномальные результаты тестов респираторной функции, 4 – пневмонию, 1 – саркоидоз, 1 – кардиомегалию и 6 отказались от участия.

Контрольную группу составили 164 здоровых донора крови, 101 мужчина и 63 женщины в возрасте от 18 до 63 лет (среднее ± SD, 38,3 ± 10,4 года), у которых не было кашля в анамнезе в течение предыдущих 12 недель. Сыворотки из контрольной популяции были получены в тот же период, что и образцы от пациентов.

Возраст и пол каждого пациента были записаны, и была получена история болезни, включая информацию о привычках к курению, лихорадке, использовании антибиотиков и кашле. Были выполнены рентгенография грудной клетки (с переднезадней и боковой проекциями) и спирометрия.При первом посещении были получены следующие образцы: носоглоточный аспират для ПЦР B. pertussis , образец носоглоточного мазка с альгинатом кальция для посева на B. pertussis и образец крови для серологии B. pertussis (острая сыворотка) .

Четыре недели спустя был взят второй образец крови на B. pertussis серологически у 188 пациентов (сыворотка выздоравливающего). Тринадцать пациентов отказались от повторного анализа крови. Носоглоточный аспират и сыворотки хранили при -80 ° C до тестирования.По завершении исследования сыворотки анализировали партиями. Образец сыворотки для оценки среднего геометрического титра антител IgG к коклюшному токсину был получен от каждого из участников контрольной популяции.

Культура B. pertussis. Образцы носоглоточных мазков немедленно помещали на среду, специфичную для B. pertussis [13], и инкубировали при 37 ° C и высокой влажности в течение 7 дней. Идентификация была основана на форме колонии, положительности по оксидазе, микроскопии грамотрицательных палочек и реакции с флуоресцеин-конъюгированным B.pertussis (Bacto FA Bp ; Difco Laboratories, Детройт).

Анализ ПЦР B. pertussis. Для выделения ДНК 100 мкл носоглоточного аспирата обрабатывали 20 мкл дитиотреитола (60 мг / мл; D0632, Sigma, Diesenhofer, Германия) и 30 мкл протеиназы K (10 мг / мл; 745723, Boehringer Mannheim, Мангейм, Германия). ) в течение 2 ч при 56 ° С; затем добавляли 200 мкл Chelex 100 (90 мг / мл; 143-2832, Bio-Rad, Richmond, CA) [14], нагревали при 98 ° C в течение 15 минут и центрифугировали при 20000 g в течение 15 минут. .Двадцать мкл раствора, содержащего 100 мМ ТРИС и 10 мМ ЭДТА (pH 7,4), смешивали с 180 мкл супернатанта. Для ПЦР-анализа использовали пять мкл.

Вложенная ПЦР-система B. pertussis , описанная He et al. использовалась [11]. Эта система обнаруживает 2–3 бактерии в реакционной пробирке и является 100% специфичной при тестировании против 130 бактериальных штаммов [11]. В смоделированном образце, состоящем из 100 мкл буфера ТЕ (10 мМ ТРИС и 1 мМ ЭДТА [pH 7,5]) и известного количества ДНК B. pertussis , предел обнаружения составил 375 фг для B.pertussis , что эквивалентно ∼70–80 копий генома (при размере генома 3750 т.п.н.) [15].

Продукт ПЦР визуализировали электрофорезом в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Положительный тест определялся полосой из 124 п.н. [11]. Для каждых 10 образцов были проведены положительный и отрицательный контроль. Чтобы проверить вещества, ингибирующие ПЦР, мы провели параллельную количественную ПЦР для каждого образца с 4 мкл образца пациента и известным количеством извлеченной ДНК Chlamydia trachomatis в качестве целевой ДНК для ПЦР.Параметры цикла были такими, как описано в [16].

Определение антител к токсину коклюша . ELISA был адаптирован из метода Meade et al. [17]. Все засеянные объемы составляли 50 мкл. Планшеты для микротитрования из полистирола (NUNC-IMMUNOSORB maxisorb; NUNC, Роскилле, Дания, код № 439454) покрывали токсином коклюша (1 мкг / мл в карбонатном буфере; pH 9,6) в течение ночи при 4 ° C. Тестируемая и контрольная сыворотки разводили в 2 раза в планшете в буфере для разведения (pH 7,2), состоящем из PBS, 1% об. / Об. Triton-X 100 (Serva 37240, Serva Electrophoresis, Heidelberg, Germany) и 1% бычьего сывороточного альбумина. и инкубировали в течение 2 ч при 20 ° C или в течение ночи при 4 ° C.Через 30 мин развитие окраски было остановлено с помощью 100 мкл 2-M H 2 SO 4 , и поглощение считали при 492 нм. Эффективность каждой сыворотки рассчитывали с помощью метода контрольных линий и данных, преобразованных в логарифмический логарифм. Серологический диагноз B. pertussis был основан либо на 4-кратном увеличении уровня антител IgG к коклюшному токсину, либо на одном значении антител IgG к коклюшному токсину, на 2 стандартных отклонения выше среднего геометрического в контрольной группе [2, 5] .Парные сыворотки индивидуума анализировали на одном планшете для микротитрования ELISA. Контрольную сыворотку для анализа анализировали на каждом микротитровальном планшете для отслеживания вариабельности анализа.

На протяжении всего исследования мы использовали эталонную антисыворотку против коклюша (человеческую) из США, лот 3 (Лаборатория эталонных реагентов, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, Вашингтон, округ Колумбия), разведенную 1: 1000 в буфере для разведения. Для обнаружения связанных IgG-антител к коклюшному токсину мы использовали конъюгированные с пероксидазой козьи антитела к человеческому IgG (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD; каталожный номер.074-1002), разводили 1: 10 000 в буфере для разведения и инкубировали в течение 1 ч при 20 ° C. О-фенилендиамин использовали в качестве цветного субстрата.

Статистика . Для анализа данных мы использовали Статистический пакет для социальных наук версии 6.0 (SPSS, Чикаго) [18]. Для дихотомических переменных использовался критерий χ 2 , а для непрерывных переменных – критерий Стьюдента t или непараметрический критерий Манна-Уитни. Для парных сравнений использовался непараметрический критерий Вилкоксона.Коэффициент вариации рассчитывали как стандартное отклонение, деленное на среднее значение контрольных значений сыворотки для анализа, выраженное в процентах. Значение P ниже 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

У 201 пациента при включении в исследование был постоянный кашель в среднем в течение 6,5 недель. Четыре (2%) из этих пациентов имели положительный посев на B. pertussis . Одиннадцать (5,5%) носоглоточных аспиратов были B.pertussis ПЦР-положительных, в том числе от 4 пациентов с положительным посевом (таблица 1). Вещества, ингибирующие ПЦР, не обнаружены ни в одном образце.

Таблица 1

Характеристики пациентов, положительных на Bordetella pertussis по результатам ПЦР.

Таблица 1

Характеристики пациентов, положительных на Bordetella pertussis по результатам ПЦР.

Средний титр антител IgG к коклюшному токсину у пациентов, положительных на B.pertussis с помощью ПЦР был значительно выше, чем в контрольной популяции ( P <0,0001). Среднее геометрическое плюс 2 стандартных отклонения для антител IgG к коклюшному токсину в контрольной популяции составило 123 Ед / мл (специфичность 97,5%). Тридцать три пациента имели уровень антител IgG к коклюшному токсину> 123 Ед / мл; эти 33 включали всех пациентов с положительным посевом и 10 из 11 B. pertussis пациентов с положительным результатом ПЦР. Ни у одного пациента не было 4-кратного увеличения титра антител IgG к токсину коклюша от первого до второго обследования.Средний титр антител IgG к токсину коклюша в сыворотке крови острой фазы был значительно выше, чем в сыворотке выздоравливающих ( P <0,004). B. pertussis серопозитивность не зависела от возраста и пола. Коэффициент вариации между исследованиями для ELISA на коклюшный токсин IgG составил 11,7%.

Один пациент был B. pertussis ПЦР-положительным, но не имел ответа антител к токсину коклюша (таблица 1). Пациентка была 34-летней женщиной, у которой на момент обследования в течение 4 недель был сухой приступообразный кашель.Кашля в анамнезе не было. Она не могла вспомнить, была ли она вакцинирована против B. pertussis . Ее сестра тоже кашляла. В день обследования в палате не было других пациентов с инфекцией B. pertussis .

Соотношение мужчин и женщин или возрастное распределение для пациентов с серологическими признаками инфекции B. pertussis не отличалось от пациентов без инфекции B. pertussis ; мы также не обнаружили никаких различий в частоте лихорадки, лечения антибиотиками, привычек курения или кашля в анамнезе (недели кашля, сухой или продуктивный кашель, дневной или ночной кашель или приступообразный кашель с рвотой).Кроме того, при сравнении пациентов, инфицированных B. pertussis , подтвержденных с помощью ПЦР, с пациентами, инфицированными B. pertussis , отрицательными по ПЦР, никакой разницы в вышеупомянутых параметрах выявить не удалось. Кашель членов семьи чаще отмечался у пациентов, которые были B. pertussis ПЦР-положительными и серологически положительными, чем у пациентов, у которых присутствие B. pertussis не могло быть продемонстрировано ни одним из этих тестов ( P <. 01).

Обсуждение

Врачи обычно считают распространенность коклюша у взрослых низкой [19, 20], а в недавней обзорной статье о хроническом кашле не упоминается B.pertussis [21]. Однако исследования, проведенные в Германии [10] и США [2–5], показывают, что распространенность B. pertussis у взрослых с кашлем не может быть незначительной. Настоящее исследование коклюша у взрослых с постоянным кашлем проводилось в популяции, в которой не оценивались пациенты с вероятной этиологией кашля, отличной от инфекции.

Используя прямое определение посевом и B. pertussis ПЦР, бактерии коклюша или их ДНК могут быть обнаружены в 2% и 5%.5% пациентов с непрекращающимся кашлем соответственно. Более высокий уровень обнаружения B. pertussis с помощью ПЦР, чем при культивировании, был такого же порядка величины, как описано Schmidt-Schlaepfer et al. [22]. Уровень выделения B. pertussis при посеве мог быть даже выше, если бы для посева использовались носоглоточные аспираты; шведское исследование показало, что из аспиратов можно получить больше изолятов, чем из образцов носоглоточного мазка [23].

На первом осмотре испытуемые в нашем исследовании кашляли в среднем 6 раз.5 недель, и возможно, что больше пациентов были бы положительными при посеве или ПЦР, если бы они были обследованы на более ранней стадии заболевания [8, 24]. В немецком испытании эффективности вакцины, в ходе которого члены семьи обследовались, когда они кашляли в течение 1 недели, восемь из 21 пациента, обследованного с помощью ПЦР, были B. pertussis ПЦР-положительными [10]. У двух наших пациентов после 12 недель кашля оставалось посевов B. pertussis и положительных результатов ПЦР; однако мы не можем исключить возможность того, что у этих двух пациентов коклюш был суперинфекцией.

Серологические доказательства инфекции B. pertussis были обнаружены у 16,4% пациентов, включая 10 из 11 B. pertussis ПЦР-положительных пациентов. Наш вывод о том, что кашляющие члены семьи чаще наблюдались среди пациентов с серологическим подтверждением B. pertussis , чем среди пациентов без серологических доказательств коклюша, подтверждает мнение о том, что пациенты с положительными серологическими исследованиями действительно были инфицированы вирусом B. pertussis , который очень заразен. .

Исследование в США и одно в Австралии, в котором все диагнозы B. pertussis основывались на 1 высоком титре антител, и 2 исследования в США, в которых основывались большинство диагнозов B. pertussis . на 1 высокий титр антител – хотя немногие диагнозы были основаны на 4-кратном повышении титра – обнаружено, что распространенность B. pertussis составляет 12–26% среди взрослых пациентов с хроническим кашлем [2–5]. Deville et al., Которые анализировали антитела к токсину коклюша 6 раз в год в течение 5 лет, обнаружили свидетельства того, что среднегодовая частота инфицирования коклюшем составляет 8% [25].В это исследование не было включено никакой исторической информации.

У нашей исследуемой группы был смешанный фон вакцинации против коклюша, и многие пациенты были инфицированы в детстве B. pertussis , что может дать быстрый анамнестический иммунный ответ. Таким образом, повышение титра антител IgG к коклюшному токсину может быть пропущено при взятии «острой» сыворотки на поздней стадии заболевания [26], и это может объяснить, почему ни одна из наших парных сывороток не показала 4-кратное увеличение титра Антитела IgG к токсину коклюша.Однако мы наблюдали снижение титров таких антител от первого ко второму обследованию, что аналогично результатам Simondon et al. [27].

Не было обнаружено различий в истории кашля между группами с доказательством инфекции B. pertussis и без нее, независимо от того, сравнивали ли мы результаты тестов посева, ПЦР или серологии. Это согласуется с выводами Wright et al. [2] и Mink et al. [3], которые пришли к выводу, что болезни пациентов с коклюшем аналогичны болезням пациентов без коклюша.Однако в предыдущих исследованиях диагноз инфекции B. pertussis для некоторых пациентов основывался только на анамнезе [28, 29]. Наше исследование и исследования Wright et al. [2] и Mink et al. [3] указывают, что диагноз инфекции B. pertussis не должен основываться только на анамнезе и что необходим диагностический метод, по крайней мере, для взрослых.

ПЦР-анализ кажется лучше, чем посев, а серология может превосходить ПЦР на поздней стадии заболевания.Однако, если диагноз инфекции B. pertussis основан на тесте на антитела к коклюшному токсину в одном образце сыворотки, чувствительность и специфичность теста зависят от выбранного диагностического порогового значения [3]. Если пороговые значения средних титров антител IgG к токсину коклюша будут установлены на уровне плюс 2 стандартных отклонения, 2,5% пациентов без коклюша будут соответствовать определению случая по статистической случайности; если установлено 3 стандартных отклонения, 0,5% пациентов. Кроме того, пациенты со значением антител, близким к диагностическому пороговому значению, могут быть неправильно диагностированы из-за вариабельности анализа.Следовательно, серология и ПЦР могут быть дополнительными в диагностике инфекции B. pertussis .

Один пациент был B. pertussis ПЦР-положительным, но не смог сформировать ответ антител против коклюшного токсина, который был описан у детей с инфекцией B. pertussis [8]. Возможен ложный результат ПЦР B. pertussis из-за контаминации, но наша лаборатория ПЦР организована в соответствии с рекомендациями Kwok и Higuchi [30], и все отрицательные контроли были отрицательными во время исследования.

В заключение, мы продемонстрировали присутствие B. pertussis с помощью посева или анализа ПЦР у 5,5% взрослых пациентов, у которых был постоянный кашель в течение 2–12 недель. Если бы пациенты были обследованы на более ранней стадии заболевания, частота положительного посева B. pertussis и положительного результата ПЦР могла бы быть еще выше, потому что у 16,4% пациентов были серологические доказательства недавнего B. pertussis инфекционное заболевание.

Обнаружение микроорганизма посевом или ПЦР у пациентов с симптомами заболевания означает, что пациент является или был очень заразным.Врачи должны знать о влиянии B. pertussis на кашель у взрослых, независимо от кашля в анамнезе, поскольку эти пациенты могут быть резервуаром для B. pertussis и потенциально могут передать инфекцию младенцам, у которых болезнь может быть разрушительным.

Благодарности

Мы благодарим Йонну Гульдберг и Марианну Бёгильд за отличную техническую помощь.

Список литературы

1,.

Хронический кашель: диагностика и лечение

,

Prim Care

,

1985

, vol.

12

(стр.

217

25

) 2,,,.

Коклюшная инфекция у взрослых с постоянным кашлем

,

JAMA

,

1995

, vol.

273

(стр.

1044

6

) 3“ и др.

Поиск инфекции Bordetella pertussis у студентов университетов

,

Clin Infect Dis

,

1992

, vol.

14

(стр.

464

71

) 4,,,,.

Инфекция Bordetella pertussis : причина стойкого кашля у взрослых

,

Med J Aust

,

1987

, vol.

146

(стр.

522

5

) 5,,,,.

Распространенность и заболеваемость коклюшем среди взрослого городского населения

,

JAMA

,

1996

, vol.

275

(стр.

1672

4

) 6,,,,.

Оценка коклюша у стажеров Корпуса морской пехоты США

,

Clin Infect Dis

,

1997

, vol.

25

(стр.

1099

107

) 7,,,.

Коклюш у взрослых: частота передачи после заражения в домашних условиях

,

Ланцет

,

1995

, vol.

346

(стр.

1326

9

) 8,,, et al.

Антитела к нитчатому гемагглютинину Bordetella pertussis и защита от коклюша у школьников

,

J Infect Dis

,

1994

, vol.

170

(стр.

705

8

) 9,,,,,.

Нераспознанная коклюшная инфекция у подростков

,

Am J Dis Child

,

1993

, vol.

147

(стр.

575

7

) 10,,,,,.

Коклюш у взрослых немцев

,

Clin Infect Dis

,

1995

, vol.

21

(стр.

860

6

) 11,,,.

Чувствительные и специфические методы полимеразной цепной реакции для обнаружения Bordetella pertussis в образцах из носоглотки

,

J Pediatr

,

1994

, vol.

124

(стр.

421

6

) 12,,,.

Использование полимеразной цепной реакции для обнаружения Bordetella pertussis у пациентов с легкими или атипичными симптомами инфекции

,

Eur J Clin Microbiol Infect Dis

,

1993

, vol.

12

(стр.

459

63

) 13,,.

Bordetella pertussis , диагностированная методом полимеразной цепной реакции

,

APMIS

,

1994

, vol.

102

(стр.

291

4

) 14,,,,.

Одностадийный метод экстракции ДНК микробов с использованием «Chelex 100», подходящий для амплификации гена

,

Res Microbiol

,

1992

, vol.

143

(стр.

785

90

) 15,.

Создание физической карты хромосомы Bordetella pertussis Tohama I

,

J Bacteriol

,

1992

, vol.

174

(стр.

7770

7

) 16,,,,.

Разработка вложенной ПЦР с использованием флуорометрии с временным разрешением для автоматического обнаружения Chlamydia trachomatis

,

Immun Infect Dis

,

1994

, vol.

4

(стр.

36

40

) 17,,, et al.

Описание и оценка серологических тестов, используемых в многоцентровом испытании бесклеточных коклюшных вакцин

,

Pediatrics

,

1995

, vol.

96

(стр.

570

5

) 18

SPSS для Windows

,

Руководство пользователя базовой системы 6.0

,

1993

Chicago

SPSS

19.

Коклюш у взрослых. Что необходимо знать врачам

,

Arch Intern Med

,

1991

, vol.

151

(стр.

1510

2

) 20.

Коклюш: взрослые, младенцы и стада

,

Ланцет

,

1992

, т.

339

(стр.

526

7

) 21.

Хронический кашель

,

Респирология

,

1997

, т.

2

(стр.

309

16

) 22,,,,,.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в сравнении с традиционной идентификацией в культуре для обнаружения Bordetella pertussis у 7153 детей

,

Clin Microbiol Infect

,

1997

, vol.

3

(стр.

462

9

) 23,,,,,.

Сравнение носоглоточного аспирата с тампоном для посева Bordetella pertussis

,

J Clin Microbiol

,

1993

, vol.

31

(стр.

50

2

) 24,.

Лабораторная диагностика коклюша: современное состояние

,

Pediatr Infect Dis J

,

1987

, vol.

6

(стр.

145

51

) 25,,, et al.

Частота нераспознанных Bordetella pertussis инфекций у взрослых

,

Clin Infect Dis

,

1995

, vol.

21

(стр.

639

42

) 26,,.

Лабораторная диагностика коклюша: состояние дел в 1997 г.

,

J Clin Microbiol

,

1997

, vol.

35

(стр.

2435

43

) 27,,,,.

Оценка иммуноферментного анализа иммуноглобулина G на токсин коклюша и нитчатый гемагглютинин в диагностике коклюша в Сенегале

,

Clin Diagn Lab Immunol

,

1998

, vol.

5

(стр.

130

4

) 28,.

От кого дети заражаются коклюшем?

,

BMJ

,

1987

, т.

295

(стр.

751

2

) 29.

Естественное течение 500 последовательных случаев коклюша: исследование населения общей практики

,

BMJ

,

1995

, vol.

310

(стр.

299

302

) 30,.

Как избежать ложных срабатываний с помощью ПЦР

,

Nature

,

1989

, vol.

339

(стр.

237

8

)

© 1999 Американского общества инфекционных болезней

Дифференциация Bordetella pertussis от Bordetella holmesii с помощью полимеразной цепной реакции

Abstract

Bordetella holmesii , появляющийся патоген, может быть ошибочно идентифицирован как Bordetella pertussis с помощью рутинной полимеразной цепной реакции (ПЦР). По некоторым данным, до 29% пациентов с диагнозом коклюш действительно имеют B.holmesii и инвазивные не респираторные инфекции B. holmesii зарегистрированы во всем мире. Этот неправильный диагноз подрывает знания об эпидемиологии коклюша и может привести к неправильным представлениям об эффективности коклюшной вакцины. В последнее время в нескольких странах значительно увеличилось количество случаев коклюша. Целью этого ретроспективного исследования было определить, способствует ли B. holmesii увеличению лабораторно подтвержденных случаев B.pertussis в Швейцарии. Мультиплексный видоспецифичный количественный ПЦР-анализ был проведен на 196 образцах носоглотки от швейцарских пациентов с подтвержденной ПЦР инфекцией Bordetella (средний возраст: 6 лет, минимум 21 день, максимум 86 лет), ранее диагностированных как Bordetella pertussis (IS 481 +). Номер B. holmesii (IS 481 +, IS 1001 -, hIS 1001 +) был идентифицирован. Мы обсуждаем, следует ли лабораториям применять специфическую ПЦР для распознавания различных видов Bordetella .Мы пришли к выводу, что в Швейцарии B. holmesii , по-видимому, циркулируют меньше, чем в соседних странах, и что стандартные диагностические процедуры не требуются. Однако, поскольку эпидемиологическая ситуация может быстро измениться, рекомендуется периодическая переоценка.

Образец цитирования: Pittet LF, Emonet S, François P, Bonetti E-J, Schrenzel J, Hug M, et al. (2014) Диагностика коклюша в Швейцарии: дифференциация Bordetella pertussis от Bordetella holmesii с помощью полимеразной цепной реакции.PLoS ONE 9 (2): e88936. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088936

Редактор: Квок Х. Чан, Университет Гонконга, Гонконг

Поступила: 7 сентября 2013 г .; Одобрена: 14 января 2014 г .; Опубликован: 19 февраля 2014 г.

Авторские права: © 2014 Pittet et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Средства на исследования были предоставлены Лабораторией геномных исследований (Отделение инфекционных заболеваний, Университетские больницы Женевы) и Центром вакцинологии и иммунологии новорожденных (Университетские больницы Женевы и Медицинский факультет Женевского университета). Спонсоры участвовали в разработке исследования и сборе данных, но не вмешивались в анализ и решение о публикации.

Конкурирующие интересы: М. Хуг и М.Альтвегг – сотрудники Bioanalytica AG, частной диагностической лаборатории, обслуживающей больницы и частных практикующих врачей. Все образцы, включенные в это ретроспективное исследование, поступили из этого учреждения и ранее были проанализированы с помощью дуплексной ПЦР в реальном времени на наличие B. pertussis и B. parapertussis. Bioanalytica не имеет никаких патентов, продуктов в разработке или продаваемых продуктов, связанных с работой, представленной здесь, и авторы подтверждают соблюдение всех политик PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Вспышки коклюша зарегистрированы во всем мире, и Bordetella pertussis выявляется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с возрастающей частотой в образцах носоглотки (NP) пациентов с симптомами. Подростки и молодые люди представляют собой главный резервуар и передают бактерии более уязвимому педиатрическому населению. В Швейцарии о кластерах коклюша необходимо сообщать в правительство, и в настоящее время заболеваемость коклюшем высока (2012: 94 / 100’000) и растет [1].

Хотя появляющийся патоген Bordetella holmesii был первоначально описан как вызывающий бактериемию у пациентов с иммунодефицитом [2], он также был обнаружен в образцах НП иммунокомпетентных лиц с симптомами коклюша [3]. Респираторная инфекция, вызванная B. holmesii , с помощью ПЦР легко может быть ошибочно идентифицирована как B. pertussis , потому что оба генома содержат последовательность вставки IS 481 , на которую нацелены анализы ПЦР, обычно используемые в большинстве лабораторий.Этот неправильный диагноз B. holmesii как B. pertussis является обычным явлением: в недавнем крупномасштабном тесте контроля качества только одна из 24 европейских лабораторий правильно идентифицировала штамм B. holmesii [4].

Точная идентификация B. holmesii важна по нескольким причинам. Один из них касается вакцины против коклюша: некоторые страны, в том числе Швейцария, внедрили или в настоящее время внедряют бустерные дозы вакцины против коклюша для подростков и / или взрослых.Эти новые рекомендации были внедрены в ответ на рост числа пациентов с симптомами коклюша и сдвиг в возрасте лет, в резервуаре B. pertussis. Основная цель уменьшения циркуляции коклюша – защитить группу риска, а именно детей раннего возраста. Однако, согласно исследованию на животных, коклюшные вакцины – как клеточные, так и бесклеточные – не защищают от B. holmesii [5]. У людей оценочная эффективность бустерной бесклеточной вакцинации против коклюша подростков против B.holmesii во время вспышки коклюша в Огайо (США) составила 36% (95% ДИ: -33%; + 69%) по сравнению с 67% против B. pertussis (95% ДИ: 38%; 82%) [ 6]. Следовательно, иммунизированные пациенты, вероятно, не защищены от инфекции B. holmesii , и последующий неправильный диагноз B. holmesii на B. pertussis может ошибочно предполагать неэффективность вакцины. Это может сильно повлиять на восприятие вакцины как врачами, так и пациентами, но также приведет к ненадлежащим мерам общественного здравоохранения.Кроме того, в настоящее время неясно, необходимо ли профилактическое лечение антибиотиками всех лиц, контактировавших с индексными случаями, такими как инфекция B. pertussis , для инфекции B. holmesii [7]. B. holmesii может – в отличие от B. pertussis – вызывать инвазивные заболевания, в основном у пациентов с ослабленным иммунитетом [2], [8], но также и у иммунокомпетентных хозяев [9] – [11]. Поэтому при обнаружении следует рассмотреть возможность обследования и лечения. Наконец, макролиды – противомикробные препараты, используемые для лечения B.pertussis – по-видимому, имеют более низкую активность против B. holmesii [12]. Исследования in vitro показывают, что наиболее эффективными антибиотиками против B. holmesii являются фторхинолоны и карбапенемы, которые редко используются для лечения коклюша [2], [13] – [14].

Респираторные инфекции, вызываемые B. holmesii , регистрируются во всем мире с разной частотой [3], [5], [15] – [20]. Исследование показало, что до 20% французских подростков и взрослых с симптомами коклюша на самом деле инфицированы B.holmesii [17]. Швейцария граничит с Францией, и ни одна из швейцарских лабораторий обычно не идентифицирует B. holmesii в пробах NP. Целью этого пилотного исследования был ретроспективный повторный анализ экстрагированной ДНК из образцов NP Bordetella -позитивных на наличие B. holmesii в нашем регионе и выяснение, может ли B. holmesii составлять часть недавний рост лабораторно подтвержденных случаев коклюша в Швейцарии.

Материалы и методы

Сохраненная ДНК, выделенная из 196 образцов NP от пациентов в Швейцарии, идентифицированных как положительные для B.pertussis или B. parapertussis с помощью рутинной ПЦР в 2009–2012 гг. повторно проанализировали с помощью триплексной видоспецифичной количественной ПЦР (qPCR).

Для рутинного теста экстракцию ДНК из клинических образцов проводили с помощью автоматизированной системы экстракции (easyMAG®, BioMérieux, Marcy-l’Etoile, Франция). Обычная количественная дуплексная ПЦР в реальном времени нацелена на IS 481 и IS 1001 и проводилась в LightCycler 2.0 (Roche, Базель, Швейцария).

Целевыми последовательностями видоспецифичной тройной кПЦР были IS 481 , IS 1001 и hIS 1001 (таблица 1).Мишень IS 481 очень чувствительна к B. pertussis : ее геном содержит> 50 копий последовательности IS 481 , но не является видоспецифичным: она также присутствует в геноме B. holmesii (8–10 копий) и у некоторых животных (иногда человека) изолятов B. bronchiseptica . Мишень IS 1001 обычно используется для диагностики B. parapertussis , хотя она также может присутствовать в некоторых штаммах B.bronchiseptica [21]. Мишень hIS 1001 была выбрана для идентификации B. holmesii , как описано ранее [22]. Таким образом, этот мультиплексный КПЦР позволил различить B. pertussis (IS 481 +, IS 1001 -, его 1001 -), B. holmesii (IS 481 +, IS 1001 – , hIS 1001 +) и B. parapertussis (IS 481 -, IS 1001 +, hIS 1001 -).Затем случайно выбранные образцы повторно тестировали с помощью симплексной кПЦР с использованием олигонуклеотидов, распознающих 5′-конец мишени коклюшного токсина ( ptxA ), которая присутствует только у B. pertussis .

Очищенная ДНК из бактериальных штаммов, используемых для валидации мультиплекса: B. pertussis (штаммы ATCC № 12742), B. parapertussis (штамм CIP107610, Институт Пастера, Париж, Франция), B. bronchiseptica (QCMD штамм Glasgow) и B.holmesii (штамм CIP104394, Институт Пастера, Париж, Франция; любезно предоставлен проф. Н. Гизо).

Последовательности генов-мишеней сканировали для конструирования специфичных для последовательности олигонуклеотидов с помощью программного обеспечения PrimerExpress 2.0 (PE Biosystems, Foster City, CA, USA) с использованием настроек по умолчанию. Условия для амплификации на CFX-96 (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США) были следующими: t1, 15 мин при 95 ° C; t2, 15 с при 95 ° С; t3, 30 сек при 60 ° C (t2 и t3 повторяются 40 раз). Объем смеси для ПЦР (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США) составлял 20 мкл и содержал праймеры и зонды в указанных концентрациях (таблица 2).Параметры анализа по умолчанию использовались с программным обеспечением прибора CFX-96; стандартное отклонение значений флуоресценции, записанных для циклов с 3 по 15, умножали на 10, чтобы определить линию порога цикла. Пороги цикла были получены из точки пересечения между этой линией и сигналом, полученным во время qPCR. Реакция считалась положительной, когда уровни флуоресценции превышали порог обнаружения между циклами 15 и 30. Уровни чувствительности кПЦР оценивали с использованием 10-кратных серийных разведений очищенной геномной ДНК из контрольного изолята в диапазоне 6 log.Чувствительность обнаружения B. pertussis и B. holmesii составляла 7–8 бактерий на образец.

После консультации с нашим институциональным наблюдательным советом (Комитет по этике исследований на людях университетских больниц Женевы) пациенты не должны были предоставлять информированное письменное согласие, поскольку образцы были необратимо анонимизированы и хранились для контроля качества. Комитет по этике отказался от необходимости одобрять исследование после подачи протокола.

Результаты

Из 196 доступных образцов NP в 194 осталось достаточно материала для повторного анализа: 188 (97%, 95% доверительный интервал (ДИ): 94–99%) были подтверждены как B.pertussis и 5 (3%, 95% ДИ: 0–5%) как B. parapertussis . Ни один из них не содержал B. holmesii (0%, 95% ДИ: 0% –1,5%). Один образец был отрицательным для всех трех целей. Ни один из положительных образцов не показал множественных сигналов, что означает отсутствие коинфекции. Эти результаты были подтверждены с помощью симплексной КПЦР, нацеленной на ptxA . Только B. pertussis , как определено анализом IS, давал положительные сигналы токсина. Обычно Ct сигнала IS появляется на 4–8 циклов раньше, чем полученный для токсина, что соответствует относительной разнице численности внутри клеток.Средний возраст пациентов составлял 6 лет (межквартильный диапазон 3–15 лет; минимальный возраст 21 день, максимальный возраст 86 лет), из них 52% составляли женщины (таблица 3).

Обсуждение

Мы не обнаружили B. holmesii в образцах NP от швейцарских пациентов с подтвержденной ПЦР инфекцией Bordetella , полученной с помощью рутинного, недискриминационного ПЦР-анализа Bordetella . Поэтому кажется маловероятным, что B. holmesii ответственны за сообщаемый рост случаев диагностики коклюша в Швейцарии.Этот результат согласуется с другими исследованиями из различных географических регионов: B. holmesii не было обнаружено в образцах от тунисских младенцев [23] или пациентов из Финляндии [24], Нидерландов [24], Канады (Альберта) [25]. ] и Австралии [26]. Напротив, B. holmesii был идентифицирован в 0,4–29% из Bordetella -положительных образцов NP из Канады (Онтарио) [16], у детей из Аргентины и Чили [15], [19], а также у подростков и детей. взрослые из Франции [17], Японии [18] и США (Массачусетс, Огайо) [3], [5] – [6].

Наши результаты были неожиданными по нескольким причинам. Во-первых, мы недавно идентифицировали B. holmesii в образцах крови двух пациентов с ослабленным иммунитетом, госпитализированных в наше учреждение, и, следовательно, ожидали «эндемичного» присутствия B. holmesii в нашей популяции [27]. Кроме того, инфекция, вызванная B. holmesii , была обнаружена у нескольких пациентов из разных регионов Швейцарии (сеть швейцарских лабораторий, личное сообщение). Следовательно, возможно, что г.holmesii циркулирует в нашей стране, но его заболеваемость низкая или что он следует эпидемическим кривым, таким как сообщалось для B. pertussis [28]. Во-вторых, B. holmesii были зарегистрированы в соседней Франции [17]. Учитывая ретроспективные условия нашего пилотного исследования, нам, к сожалению, не хватает конкретной информации о клинических проявлениях пациентов, истории иммунизации и социально-демографических характеристиках. Таким образом, неясно, отличаются ли наши пациенты от французских пациентов, о которых сообщали Njamkepo et al [17], и чем.Разница в возрасте не могла объяснить это несходство: большинство наших пациентов составляли дети 0–9 лет (113/196, 58%), но также были 41 подросток (9–17 лет, 21%) и 42 взрослых. (> 17 лет, 21%), что сопоставимо с возрастным распределением пациентов, о которых сообщалось во французском исследовании (119 детей, 20 подростков, 39 взрослых).

Самая высокая частота B. holmesii была описана у подростков и взрослых с симптомами коклюша. Однако сейчас известно, что г.holmesii может вызывать респираторные инфекции во всех возрастных группах, поскольку о детях, в том числе семи младше 6 месяцев, сообщалось в недавних публикациях из Аргентины и Чили [15], [19]. В нашем исследовании были представлены все возрастные группы: поэтому мы были удивлены, не обнаружив B. holmesii у пациентов с подтвержденной ПЦР инфекцией Bordetella . Ограничение уровня обнаружения нашей кПЦР может объяснить тот факт, что у нас нет положительного пациента. Однако серийные разведения показали уровень чувствительности около 8 бактерий, достаточный для идентификации B.holmesii в экземпляре, даже в небольшом количестве. Во всех положительных реакциях флуоресцентный сигнал появлялся довольно рано (раньше, чем цикл 30), отражая значительное количество амплифицированного целевого гена.

Наконец, мало что известно об эпидемиологии B. holmesii и его взаимодействии с эпидемиологией B. pertussis . Возможно, что на передачу B.holmesii , и различаются между странами, объясняя наблюдаемые различия.

Двумя основными ограничениями этого исследования являются его ретроспективный аспект, как обсуждалось ранее, и небольшое количество выборок. Было бы интересно получить доступ к клиническим данным пациентов и сравнить их с другими исследованиями, изучающими признаки и симптомы у пациентов с инфекциями Bordetella holmesii по сравнению с инфекциями, отличными от holmesii . В настоящее время неясно, как клинически дифференцировать пациентов с коклюшем, инфицированных другой Bordetella .По оценкам, в Швейцарии ежегодно регистрируется около 5000 случаев коклюша [1]: мы протестировали менее 200 образцов. Однако в нашем исследовании представлены все возрастные группы, и образцы бактерий были последовательно взяты у пациентов с симптомами в одном регионе.

Разница в заболеваемости B. holmesii между странами [3], [5] – [6], [15] – [19], [23] – [25] остается неизвестной и предполагает продолжение активного наблюдения. . Однако, поскольку в наших образцах не было выделено B. holmesii и из-за более высокой стоимости видоспецифичной ПЦР Bordetella , в настоящее время нет необходимости внедрять специфические диагностические процедуры в рутинном порядке.Приоритетом остается диагностика B. pertussis . Основываясь на наших результатах и ​​учитывая важность предотвращения ошибочного диагноза B. holmesii как B. pertussis , мы настоятельно рекомендуем всем регионам, сталкивающимся с растущей заболеваемостью коклюшем, использовать Bordetella видоспецифичные тесты для того, чтобы чтобы узнать, вносит ли B. holmesii свой вклад в это повышение и в какой степени. В зависимости от результата следует обсудить, нужны ли в плановом порядке видоспецифические тесты; они могут не быть указаны, если распространенность B.holmesii очень низкие, учитывая их более высокую стоимость. Однако эпидемиология обоих видов может быстро измениться, и через несколько лет следует рассмотреть возможность проведения второго исследования с видоспецифичными тестами. Поэтому на данный момент, по нашему мнению, в Швейцарии специфическая ПЦР-диагностика для B. holmesii должна использоваться только по эпидемиологическим причинам, в необычных ситуациях с пациентами или в исследованиях вакцин.

Благодарности

Мы благодарны Pr N. Guiso за любезное предоставление B.holmesii для проверки и оценки чувствительности кПЦР, а также доктору Н. Лиассину.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: CAS KMPB LFP SE JS PF. Проведены эксперименты: PF EJB. Проанализированы данные: LFP KMPB SE. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: MH MA PF EVB. Написал статью: LFP KMPB SE CAS. Критический обзор рукописи: CAS JS MA PF. Принятие окончательной версии: LFP SE PF EJB MH MA CAS KMPB.

Ссылки

  1. 1.Федеральное ведомство Санте Публик (OFSP) (2013) Адаптация рекомендаций по вакцинации против coqueluche: для подростков, частых nourrissons, структура d’accueil collectif et les femmes enceintes. Булл ОФСП 9: 118–123.
  2. 2. Шепард К.В., Данешвар М.И., Кайзер Р.М., Эшфорд Д.А., Лонсуэй Д. и др. (2004) Bordetella holmesii бактериемия: недавно признанное клиническое заболевание среди пациентов с аспеленией. Clin Infect Dis 38: 799–804.
  3. 3. Йих В.К., Сильва Е.А., Ида Дж., Харрингтон Н., Летт С.М. и др. (1999) Bordetella holmesii -подобных организмов, выделенных от пациентов из Массачусетса с симптомами коклюша. Emerg Infect Dis 5: 441–443.
  4. 4. Dalby T, Fry NK, Krogfelt KA, Jensen JS, He Q (2013) Оценка методов ПЦР для диагностики коклюша Европейской сетью эпиднадзора за болезнями, предупреждаемыми с помощью вакцин (EUVAC.NET). Eur J Clin Microbiol Infect Dis 32: 1285–1289.
  5. 5. Zhang X, Weyrich LS, Lavine JS, Karanikas AT, Harvill ET (2012) Отсутствие перекрестной защиты против Bordetella holmesii после вакцинации от коклюша. Emerg Infect Dis 18: 1771–1779.
  6. 6. Роджерс Л., Мартин С.В., Кон А., Бадд Дж., Маркон М. и др. (2013) Эпидемиологические и лабораторные особенности крупной вспышки коклюшноподобных заболеваний, связанных с одновременной циркуляцией Bordetella holmesii и Bordetella pertussis – Огайо, 2010–2011 гг.Clin Infect Dis 56: 322–331.
  7. 7. Вебер Д.Дж., Миллер МБ, Брукс Р.Х., Браун В.М., Рутала В.А. (2010) Медицинский работник с «коклюшем»: последствия ложноположительного результата теста на полимеразную цепную реакцию. Инфекционный контроль и больничная эпидемиология 31: 306–307.
  8. 8. Тартоф С.Ю., Гаундер П., Вайс Д., Ли Л., Кэссидей П.К. и др. (2014) Bordetella holmesii случаев бактериемии в США, апрель 2010 г. – январь 2011 г. Clin Infect Dis 58: e39–43.
  9. 9.Jonckheere S, De Baere T., Schroeyers P, Soetens O, De Bel A, et al. (2012) Эндокардит протеза клапана, вызванный Bordetella holmesii , аналог Acinetobacter . J Med Microbiol 61: 874–877.
  10. 10. Russell FM, Davis JM, Whipp MJ, Janssen PH, Ward PB и др. (2001) Тяжелая инфекция Bordetella holmesii у ранее здорового подростка, подтвержденная анализом последовательности генов. Clin Infect Dis 33: 129–130.
  11. 11.Моррис Дж. Т., Майерс М. (1998) Бактериемия, вызванная Bordetella holmesii . Clin Infect Dis 27: 912–913.
  12. 12. Clare S, Ahmed T, Singh R, Gough S (2010) Bordetella holmesii : редкая причина бактериального эндокардита у пациента после спленэктомии. BMJ Case Rep 2010
  13. 13. Канджи Дж., Джи С., Ахмед-Бентли Дж., Ли М.К., Нигрин Дж. И др. (2011) Bordatella holmesii бактериемия в Северной Альберте: 5-летний обзор случая. Canad J Infect Dis Med Microbiol 22: 22A.
  14. 14. Nei T, Hyodo H, Sonobe K, Dan K, Saito R (2012) Первый отчет об инфекционном перикардите, вызванном Bordetella holmesii , у взрослого пациента со злокачественной лимфомой. J Clin Microbiol 50: 1815–1817.
  15. 15. Миранда С., Возняк А., Кастильо С., Жоффруа Е., Зумаран С. и др. (2013) Присутствие Bordetella holmesii во время вспышки коклюша в Чили. Преподобный Chilena Infectol 30: 237–243.
  16. 16. Guthrie JL, Robertson AV, Tang P, Jamieson F, Drews SJ (2010) Новый дуплексный ПЦР-анализ в реальном времени обнаруживает Bordetella holmesii в образцах от пациентов с симптомами коклюша в Онтарио, Канада.J Clin Microbiol 48: 1435–1437.
  17. 17. Njamkepo E, Bonacorsi S, Debruyne M, Gibaud SA, Guillot S и др. (2011) Значительное обнаружение ДНК Bordetella holmesii в образцах носоглотки французских пациентов с подозрением на коклюш. J Clin Microbiol 49: 4347–4348.
  18. 18. Камия Х., Оцука Н., Андо Й, Одаира Ф., Йошино С. и др. (2012) Передача Bordetella holmesii во время вспышки коклюша, Япония. Emerg Infect Dis 18: 1166–1169.
  19. 19. Боттеро Д., Гриффит М.М., Лара С., Флорес Д., Пьянчола Л. и др. (2013) Bordetella holmesii у детей с подозрением на коклюш в Аргентине. Epidemiol Infect 141: 714–717.
  20. 20. Вэй К., Робинсон С.К., Ловелл М.А., Хенгартнер Р.Дж., Келли К.А. и др. (2010) Поучительная история из Колорадо: Bordetella holmesii циркулирует и может привести к ложноположительным результатам в широко используемой ПЦР Bordetella pertussis . Дж. Мол Диаг 12: 883.
  21. 21. Loeffelholz M (2012) На пути к повышению точности тестов амплификации нуклеиновых кислот Bordetella pertussis . J Clin Microbiol 50: 2186–2190.
  22. 22. Татти К.М., Спаркс К.Н., Бони К.О., Тонделла М.Л. (2011) Новый многоцелевой анализ ПЦР в реальном времени для быстрого обнаружения видов Bordetella в клинических образцах. J Clin Microbiol 49: 4059-4066.
  23. 23. Zouari A, Smaoui H, Brun D, ​​Njamkepo E, Sghaier S, et al. (2012) Распространенность инфекций Bordetella pertussis и Bordetella parapertussis у госпитализированных младенцев в Тунисе: результаты 4-летнего проспективного исследования.Диагностика Microbiol Infect Dis 72: 303–317.
  24. 24. Antila M, He Q, De Jong C, Aarts I, Verbakel H и др. (2006) Bordetella holmesii ДНК не обнаруживается в мазках из носоглотки, взятых у финских и голландских пациентов с подозрением на коклюш. J Med Microbiol 55: 1043–1051.
  25. 25. Knorr L, Fox JD, Tilley PAG, Ahmed-Bentley J (2006) Оценка ПЦР в реальном времени для диагностики инфекции Bordetella pertussis . BMC Infect Dis 6: 62
  26. 26.Кокс Х.С., Джейкоб К., Уилли Д.М., Блетчли К., Ниммо Г.Р. и др. (2013) Еще одно доказательство того, что мишень IS 481 подходит для ПЦР-детекции Bordetella pertussis в реальном времени. Патология 45: 202–203.
  27. 27. Питте Л.Ф., Эмонет С., Ансари М., Жирардин Э., Шренцель Дж. И др. (2013) Bordetella holmesii бактериемия у ребенка с нефробластомой. Swiss Med Wkly 143: 50S.
  28. 28. Lavine J, Broutin H, Harvill ET, Bjornstad ON (2010) Несовершенный иммунитет, вызванный вакциной, и передача коклюша младенцам.Вакцина 29: 11–16.
  29. 29. Тизолова А., Гуизо Н., Гийо С. (2013) Последовательности вставки, общие для видов Bordetella , и их значение для биологической диагностики синдрома коклюша. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 32: 89–96.

Как справиться со вспышкой коклюша в вашей практике – FPM

Вакцины от кори и полиомиелита эффективно снизили количество этих болезней до редкости, с которой сегодня семейные врачи почти не сталкиваются.Кроме того, бремя болезней коклюша, таких как столбняк и дифтерия, резко сократилось в Соединенных Штатах за счет относительно высоких показателей иммунизации эффективными вакцинами. Однако, вопреки мнению многих врачей, снижение иммунитета к коклюшу у взрослых и подростков означает, что коклюш не является пережитком прошлого.

Наша практика напомнила об этом недавно, когда я стал индексным пациентом во всей общине вспышке коклюша. До того, как я начал принимать антибиотики и мне поставили диагноз, я продолжал выполнять свои обязанности, как это делали бы самые умеренно больные, но преданные врачи.Я видел пациентов в офисе, окружающих в больнице и обучал студентов-медиков, несмотря на все более навязчивый кашель. Хотя у меня была проведена полимеразная цепная реакция (ПЦР) на коклюш, я начал серьезно подозревать коклюш только после того, как однажды ночью обнаружил, что кашляю и услышал единственный сомнительный возглас. Даже тогда я не полностью осознавал значение этого, как и мои партнеры. Я начал маскироваться перед обследованием детей и ждал результатов ПЦР.

Тест дал положительный результат, и наш медицинский директор связался с департаментом здравоохранения штата, который порекомендовал мне прекратить прием пациентов до тех пор, пока я не получу пять полных дней приема соответствующего антибиотика.На тот момент я уже три дня принимал азитромицин. Это означало, что мне пришлось прекратить прием пациентов на два полных дня, включая моего пациента в 8 часов утра, который уже ждал меня в смотровой. Департамент здравоохранения также рекомендовал, чтобы наш офис наблюдал и лечил профилактически всех пациентов и других пациентов, с которыми я контактировал с момента появления моих симптомов. С этим советом мы изначально были в одиночку, чтобы справиться с ситуацией, хотя на следующей неделе к нам в офис ненадолго отправили медсестру, чтобы следить за нашим прогрессом.

Как врач первичной медико-санитарной помощи в загруженном офисе с пятью поставщиками медицинских услуг я обследовал более 300 человек, со всеми из которых нужно было связаться, обследовать их на симптомы коклюша, а также провести профилактику или лечение. Перспектива была устрашающей, но серьезность ситуации стала ясна только после 10-20 телефонных звонков. «Краткое руководство по борьбе со вспышкой коклюша в отделении первичной медико-санитарной помощи» было бы ценным продуктом на тот момент. Вместо этого мы нашли длинную и иногда противоречивую информацию в Интернете, печатных материалах и устных источниках, которые мы исследовали.Тем не менее, в конце концов, нам удалось предотвратить начало потенциально крупной вспышки болезни в нашем офисе, хотя этот успех был достигнут ценой большого количества времени и энергии.

КЛЮЧЕВЫЕ МОМЕНТЫ
  • Заболеваемость коклюшем в Соединенных Штатах продолжает расти по мере ослабления иммунитета у взрослых и подростков.

  • Семейные врачи должны подумать, как бы они отреагировали, если бы кто-то из их практик стал индексным случаем вспышки коклюша.

  • Определение вариантов лечения является важной частью управления вспышкой коклюша.

Начало

Катаральная (т. Е. Заложенность носа) стадия коклюша у меня началась 11 октября 2004 года. Я был уверен в этой дате, потому что моя жена отметила в своем дневнике, что я «схожу с ума». ошибка »в тот день. Эта начальная дата стала особенно важной, потому что она установила начало моего инфекционного периода и определила количество пациентов, с которыми нам нужно будет связаться и лечить.Изначально я недооценил появление своих симптомов на три-четыре дня. Как и многие другие медицинские работники, я не особо беспокоился о типичных вирусных симптомах в себе. Таким образом, дневниковые записи стали ключевой частью эпидемиологических данных.

Поскольку самая высокая заболеваемость и смертность, связанные с Bordetella pertussis, наблюдаются у младенцев в возрасте от 6 до 12 месяцев, мой офис больше всего интересовался контактом с этой группой, а также с беременными пациентами и пациентами с маленькими детьми дома.До середины 1940-х годов, когда была впервые представлена ​​цельноклеточная вакцина против дифтерии, столбняка и коклюша (АКДС), в Соединенных Штатах ежегодно регистрировалось более 160000 случаев коклюша и более 5000 смертей, связанных с коклюшем1. у детей младше 6 месяцев, при этом наиболее частым осложнением является бактериальная пневмония.

Однако после начала плановой иммунизации заболеваемость коклюшем снизилась на 99 процентов к 1976 году.1 Тем не менее, с 1980 по 2000 год заболеваемость коклюшем в Соединенных Штатах выросла в четыре раза.2 Число зарегистрированных случаев составило 11 647 в 2003 г. и подскочило до 18 957 в 2004 г. 3,4 Наша практика стала частью этого всплеска новых случаев.

Обследование и лечение

Мы посвятили нашего офис-менеджера и двух из шести медсестер выполнению стоящей перед нами административной задачи. Разговоры с ключевыми сотрудниками нашей больницы о медицинских проблемах убедили нас в том, что нам нужно связываться с каждым пациентом индивидуально по телефону или лично, а не по почте, как мы изначально планировали.

В первый день борьбы со вспышкой, окт.23 года мы начали звонить пациентам и записывать наши разговоры в карту. Наш первоначальный прогресс был медленным, из-за чего стало очевидно, что для связи с пациентами, представленными на окружающих нас диаграммах, потребуется больше времени, чем предполагалось. Эти таблицы были составлены на основе списков пациентов, которых я наблюдал в течение 12 дней с момента начала болезни.

Чтобы облегчить процесс выявления пациентов с симптомами коклюша, я создал шаблон, который мы использовали для скрининга пациентов, с которыми мы связались.Эта форма документирует следующее: симптомы, лекарственные аллергии, противопоказания к лечению и профилактическому лечению или рекомендации, которые необходимо немедленно увидеть для тестирования и лечения. Любого пациента, у которого были симптомы, осматривали и оценивали после того, как его замаскировали при входе в офис. Если при посещении подтверждались соответствующие симптомы, пациента проверяли на коклюш и рекомендовали избегать тесного контакта с другими людьми во время лечения.

Бригада инфекционистов нашего медицинского центра рекомендовала провести ПЦР у пациентов с симптомами заболевания.Этот метод дает относительно быстрые результаты и полезен, даже если пациенты уже лечились антибиотиками, чего нельзя сказать о посеве. Тем не менее, посев по-прежнему считается золотым стандартом диагностики коклюша, поскольку он на 100 процентов специфичен. Чувствительность, однако, значительно варьируется: от более 50 процентов в идеальных условиях до менее 20 процентов2. Организм довольно требователен, и его необходимо поддерживать в живых после отбора проб, чтобы обеспечить его рост на питательной среде.К факторам, снижающим чувствительность посевов, относятся задержки при прямом посеве образцов, использование транспортных сред перед прямым посевом, задержки в получении образца после двух недель болезни, отбор образцов у пациентов, уже получавших антибиотики, или культивирование ранее вакцинированных пациентов. Результат – потенциально высокий уровень ложноотрицательных результатов и продолжающееся распространение болезни. Однако культура имеет значительное преимущество в стоимости. Следовательно, другие местные медицинские учреждения предпочли использовать посев, а не ПЦР.

Определение вариантов лечения стало важной частью борьбы со вспышкой коклюша. С помощью телефонных консультантов нашего Медицинского центра Херши мы определили терапию антибиотиками первого и второго ряда. Существуют данные об использовании эритромицина и других макролидов, а также триметоприма / сульфаметоксизола. Однако пациентам с аллергией или непереносимостью этих препаратов нам посоветовали предложить доксициклин или левофлоксацин в качестве альтернативы отсутствию лечения. Недавно выпущенный кетолид, телитромицин (Кетек), также считался эффективным на основании исследований in vitro, но мы не предлагали его из-за ограниченного практического опыта с этим новым препаратом.

ФОРМА ДЛЯ СКРИНИНГА PERTUSSIS

Скачать в формате PDF

Разработано Майклом П. Фланаганом, доктором медицины, FAAFP. Авторское право © 2005 Американская академия семейных врачей. Врачи могут делать фотокопии или адаптировать для использования в своей практике; все остальные права защищены. «Как справиться со вспышкой коклюша в вашей практике». Фланаган депутат. Управление семейной практикой. Июль / август 2005 г .: 31–34; https://www.aafp.org/fpm/20050700/31howt.html.

Последнее слово

После стабильной работы в течение четырех дней, включая большую часть выходных, мы смогли связаться с более чем половиной людей, которых я неосознанно разоблачил.Мы также уведомили других местных врачей о вспышке болезни, при необходимости предоставив информацию о лечении болезни.

Помощь двух медсестер-инфекционистов нашей больницы, медперсонала и медицинского персонала нашего офиса, которые работали сверхурочно, позволила нам связаться со всеми пациентами из группы высокого риска в течение 48 часов. Впоследствии мы назначили одну медсестру в офисе, которая на следующей неделе будет проводить последующие телефонные звонки пациентам, которые не были доступны при первом звонке, и составлять таблицы по мере того, как пациенты достигаются и удаляются из нашего списка контактов.Тесные отношения врача и пациента с большинством этих пациентов облегчили этот процесс.

В конце концов, мы смогли документально подтвердить, что ни один подтвержденный случай коклюша не возник в результате прямого контакта со мной, хотя в последующие недели местные врачи диагностировали более 100 неродственных, внебольничных случаев.

Только через два месяца после моей болезни я смог определить, где я заразился коклюшем. Мое заражение, вероятно, произошло от 13-летнего соседа, который в конечном итоге был признан подтвержденным заболеванием на основе эпидемиологических данных, а не от пациента, которому я не смог поставить диагноз.Я отвез своего соседа и трех других студентов домой с церковного мероприятия за две недели до того, как у меня появились симптомы. Проведя вместе 45 минут в машине, она часто кашляла на пассажирском сиденье рядом со мной, произвела адекватную экспозицию.

Это было событие, которое стало весьма поучительным опытом, не последнее из которых произошло совсем недавно, когда один из моих азиатских пациентов поделился китайским термином для коклюша: 100-дневный кашель.

Выявление коклюша у детей с кашлем любой продолжительности | BMC Pediatrics

Дизайн исследования и участники

Проспективное исследование было проведено в период с 1 января 2016 года по 31 мая 2017 года в амбулаторных и стационарных отделениях детской больницы провинции Цзянси.Критериями включения в исследование были дети с: (а) наличием кашля (острый, определяемый как продолжительность кашля <2 недель, подострый, 2–4 недели, хронический, как> 4 недель) [11], (b) в возрасте ≤14 лет. лет, (c) без лихорадки и отсутствия свистящего дыхания, (d) отсутствие результатов, указывающих на альтернативную этиологию кашля, кроме коклюша (например, удары пальцами, как указано при хроническом заболевании легких или сердца; недостаточность развития , как указано при иммунодефиците, муковисцидозе). Критерием исключения были: (а) те, кто ранее участвовал в этом исследовании, или (б) известные хронические заболевания легких (д.г. астма) или другие заболевания (например, гастроэзофагеальный рефлюкс, сердечные заболевания или иммунодефицит).

Первичный автор обращался к потенциальным новобранцам, идентифицированным с помощью клинической карты и физического осмотра в течение 48 часов после поступления или первого посещения. Тем, кто соответствовал критериям включения, была предоставлена ​​соответствующая информация для набора. После получения информированного согласия, демографических данных и подробного медицинского анамнеза (включая вакцинацию, DTaP широко использовалась после 2012 года в Китае, обычно три дозы DTaP обычно вводятся младенцам в возрасте 3, 4 и 5 месяцев, а также бустерная доза. дается в возрасте 18 месяцев), и было проведено клиническое обследование.По возможности были взяты двусторонние мазки из глубокого заднего носоглотки (НПВ) и венепункция для полного анализа крови, СРБ, серологического исследования и мокроты. Исследование было одобрено этическим комитетом детской больницы провинции Цзянси, и от каждого родителя / опекуна было получено письменное информированное согласие.

Мокрота и микробиологическая идентификация

Были собраны образцы мокроты спонтанно, если ребенок мог откашливать, и индукция мокроты проводилась, если ребенок не мог откашливать.Образцы мокроты были обработаны микробиологической лабораторией больницы в течение 30 минут. Иммунофлуоресценция использовалась для определения присутствия следующих вирусов в мокроте: респираторно-синцитиального вируса (RSV), аденовируса, вируса гриппа (A и B) и вируса парагриппа (1,2,3) (Diagnostic Hybirds, Inc. ).

Два образца НПВ через обе стороны носовой полости были обработаны для культивирования коклюша соответственно, а затем объединены для ПЦР. Для культивирования каждый НПВ немедленно высевали на одну чашку с угольным агаром (OXOID, Великобритания) с 10% дефибринированной овечьей кровью и цефалексином и инкубировали при 35–37 ° C.После культивирования NPS немедленно замораживали при -80 ° C. Чашку с агаром инкубировали в течение 7 дней. Колонии, предположительно принадлежащие B. pertussis , прошли тест на агглютинацию на предметном стекле с антисыворотками B.pertussis и B.parapertussis (Remel Europe Ltd., Великобритания) [12]. Подтвержденные колонии субкультивировали на новой чашке с агаром с кровяным углем без цефалексина для сохранения. Все изолированные штаммы хранили при -60 ° C до дальнейшего анализа.

Для ПЦР – метод ПЦР в реальном времени, в котором амплифицирован конкретный геном B.pertussis , т.е. промоторная область гена, кодирующего субъединицу S1 токсина коклюша (ptxA) и вставочный элемент IS481 [13], последовательности ptxA-Pr были 5′-CCA ACG CGCA TG CG TG CAG ATTCGTC- 3 ‘и 5’ -CCCTCTG CG TTTTG ATGG TGCCTA TTTTA – 3 ‘, последовательности IS481 были 5′-G ATTCAA TAGGTTG TA TGCATGGTT-3’ и 5 ‘- TGG ACCATTTCGAG T CGACG-3’. Размер ампликонов составлял 191 пн и 145 пн соответственно. Результат ПЦР в реальном времени для B. pertussis положительный был определен по положительному сигналу амплификации как в ПЦР IS481, так и в ptxA-pr.

Е-тест-полоски использовали для тестирования чувствительности изолятов B.pertussis к эритромицину, азитромицину, сульфаметоксазолу / триметоприму, левофлоксацину, амоксициллину и доксициклину. MIC, определенные с помощью E-теста, измеряли через 4 дня инкубации. Staphylococcus aureus atcc29213 были включены в каждую серию тестов на чувствительность для контроля качества.

Поскольку не было контрольных точек для колонизации B.pertussis , рекомендованных Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI) [14] и Европейским комитетом по тестированию чувствительности к противомикробным препаратам (EUCAST) [15], диапазоны MIC50, MIC90 и MIC были доложены подробно.Контрольные точки Haemophilus influenza , колонизирующих обычно в носоглотке в CLSI и EUCAST, были заимствованы для анализа чувствительности существующих изолятов B.pertussis . Этот анализ должен был выявить восприимчивость знакомым способом.

Кровь и серология

Образцы периферической крови были исследованы на CRP, индексы количества лейкоцитов, серологию IgM на Mycoplasma pneumoniae (MP) , Chlamydia pneumoniae (CP), респираторно-синцитиальный вирус (RSV) и Legionella pneumophilia (LP) и IgG к токсину против коклюша (anti-PT) и anti-pertactin (anti-PRN).Для всех серологических исследований использовали коммерчески доступные наборы для ELISA (FUJIREBIO INC .; ZHU HAI LIVZON DIAGNOSTICS INC .; BEIJING BEIER BIOENGINEERING CO.LTD; Euroimmun, Любек, Германия). Результаты по антителам к коклюшу были представлены в международных единицах на миллилитр (МЕ / мл) и относились к «Первому международному стандарту антисыворотки против коклюша», код NIBSC: 06/140, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ).

Определение случая коклюша

Считалось, что у пациента определенно B.pertussis , если культура или ПЦР оказались положительными на B. pertussis [16]. «Вероятная инфекция B. pertussis » определялась, когда анти-PT IgG составлял ≥62,5 МЕ / мл, если пациенту не делали вакцинацию против коклюша в предыдущие 12 месяцев [17]. Лабораторно подтвержденным коклюшем в этом исследовании рассматривался либо определенный коклюш, либо вероятный коклюш.

Статистический анализ

Все анализы были выполнены с использованием SAS v.10 (SAS Institute Inc., США). Для сравнения частот между группами использовались критерий хи-квадрат и точный критерий Фишера. Тест Вилкоксона / Крусакала Уоллиса использовался для сравнения непрерывных переменных между группами. Там, где непрерывные данные не были нормально распределены, представлены медианы с соответствующими интерквартильными диапазонами (IQR). Статистическая значимость считалась присутствующей, если двустороннее значение p составляло <0,05.

BORDETELLA R-GENE® & Bordetella parapertussis R-GENE® – продукты для клинической диагностики

BORTEDELLA R-GENE ® & Bordetella parapertussis R-GENE преимущества

Коклюш, широко известный как коклюш, представляет собой инфекцию верхних дыхательных путей, вызываемую Bordetella pertussis . Bordetella parapertussis вызывает бактериальное заболевание, похожее на коклюш, но обычно более легкое. Оптимизированное обнаружение инфекции Bordetella имеет решающее значение для обеспечения наилучшего лечения пациентов. BORDETELLA R-GENE ® обеспечивает быстрое и специфическое обнаружение бактерий Bordetella , содержащих последовательность IS481, наиболее часто встречающуюся в Bordetella pertussis . Аналогичным образом, Bordetella parapertussis R-GENE разработан для обнаружения области IS1001 из Bordetella parapertussis .

Оба анализа можно проводить на образцах из дыхательных путей (носоглоточная аспирация и отхаркивание). Для еще более оптимизированного и всестороннего тестирования вы можете использовать диапазон ARGENE ® Respiratory для обнаружения различных респираторных вирусов и бактерий в одном образце или для анализа различных образцов на один вирус одновременно .

  • Чувствительный и воспроизводимый
    • Надежный Обнаружение Bordetella pertussis и Bordetella parapertussis инфекций
    • Все элементы управления включены
  • Стандартизированный
    • Единая обработка с ARGENE ® Ассортимент респираторных продуктов (Influenza A / B R-GENE ® , RSV / hMPV R-GENE R & Chino / Chino ® , AdV / hBoV R-GENE ® , Chla / Myco pneumo R-GENE ® , HCoV / HPIV R-GENE ® , Legio pneumo / Cc R-GENE ® )
    • Гармонизированные профили тестов для множественных анализов за один запуск
  • Гибкий
    • Утвержден для использования с различными типами образцов
    • Подходит для использования вручную или с автоматизированной пробоподготовкой , такой как EMAG ® и NucliSENS ® easyMAG ® , и платформами настройки анализа, такими как eSTREAM ® , система обработки жидкости
    • Квалифицировано с основными платформами ПЦР в реальном времени

Полный комплект со всем необходимым

BORDETELLA R-GENE ® и Bordetella parapertussis R-GENE ® – это готовых к использованию наборов , которые обнаруживают присутствие Bordetella pertussis и Bordetella parapertussis с использованием времени PC после выделения ДНК.Эта технология Taqman на основе 5’-нуклеаз усиливает и одновременно обнаруживает конкретную область бактериального генома.

  • Внутренний контроль (IC2) проверяет процесс экстракции, включая лизис, и наличие ингибиторов амплификации в образце
  • Положительный и Отрицательный контроль
  • Каждый набор Включает все необходимых реагентов оптимизирован для обнаружения Bordetella pertussis или Bordetella parapertussis для in vitro диагностического использования

Простая процедура

Использовать наборы BORDETELLA R-GENE ® и Bordetella parapertussis R-GENE ® просто.Просто добавьте извлеченный образец ДНК в готовую к использованию мастер-смесь для ПЦР и запустите реакцию на соответствующем термоциклере для ПЦР в реальном времени, следуя оптимизированной программе циклирования, описанной в «Инструкции по применению».

BIOMERIEUX, синий логотип, ARGENE ® , R-GENE ® , EASYMAG ® и NUCLISENS ® используются, на рассмотрении и / или зарегистрированы торговые марки, принадлежащие компании bioMérieux, или одной из ее дочерних компаний, или одной из свои компании. Любое другое название или товарный знак является собственностью соответствующего владельца.

Краткие сведения о

Bordetella pertussis и Bordetella parapertussis

Что такое Bordetella pertussis и Bordetella parapertussis ?

Коклюш, известный как коклюш, – очень заразное респираторное заболевание, которым в основном страдают дети в возрасте до 5 лет. Это вызвано грамотрицательным бактериальным патогеном Bordetella pertussis , одним из девяти видов Bordetella , идентифицированных сегодня.Этот патоген производит токсин коклюша, приводящий к воспалительным и некротическим нарушениям.
Bordetella parapertussis была определена как ответственная за ослабленную форму коклюша, называемую парапертуссом. Эти бактерии попадают в организм через дыхательные пути и прикрепляются к слизистой оболочке верхних дыхательных путей (трахеи и бронхов).

Кто подвергается наибольшему риску?

Инфекция, вызванная Bordetella pertussis , может быть очень серьезной – даже со смертельным исходом – у младенцев до 6 месяцев, потому что у них нет иммунитета против болезни (материнские антитела против коклюша не проникают через плаценту).Затем заболевание может привести к респираторным осложнениям (апноэ и бактериальные инфекции). Однако коклюш может вызвать заболевание у людей любого возраста. Примерно 40% случаев могут протекать бессимптомно. В хорошо вакцинированных странах смертность и заболеваемость снизились на 95%. Тем не менее, изменение способа передачи заболевания наблюдается в течение нескольких лет в отсутствие естественной или вакцинационной бустерной вакцинации. Он больше не передается только среди детей, а от взрослых или подростков невакцинированным младенцам.

Каковы преимущества тестирования Bordetella pertussis и B. parapertussis ?

ПЦР в реальном времени – эффективная альтернатива для диагностики Bordetella , поскольку она предлагает чувствительные, специфические и более быстрые результаты по сравнению с посевом, тем самым способствуя лучшему ведению пациентов.

BORDETELLA R-GENE ® и Bordetella parapertussis R-GENE ® : ПУБЛИКАЦИИ
  1. Этюд совместной работы CNR de la coqueluche et des Laboratoires Госпитальеры (RENACOQ) и Privés (LAM), оценивающий PCR в реальных условиях для обнаружения материальной génétique de Bordetella
    Guillot et al .Национальный центр по борьбе с коклюшами и бордетеллозами. РИКАИ 2010
  2. Разработка нового диагностического инструмента для обнаружения Bordetella pertussis с помощью ПЦР в реальном времени
    Vignoles et al . АРГЕНА. ESCV 2009

журналов открытого доступа | ОМИКС Интернэшнл

  • Дом
  • О нас
  • Открытый доступ
  • Журналы
    • Поиск по теме
        • Acta Rheumatologica Журнал открытого доступа
        • Достижения в профилактике рака Журнал открытого доступа
        • Американский журнал этномедицины
        • Американский журнал фитомедицины и клинической терапии
        • Обезболивание и реанимация: текущие исследования Гибридный журнал открытого доступа
        • Анатомия и физиология: текущие исследования Журнал открытого доступа
        • Андрология и гинекология: текущие исследования Гибридный журнал открытого доступа
        • Андрология – открытый доступ Журнал открытого доступа
        • Анестезиологические коммуникации
        • Ангиология: открытый доступ Журнал открытого доступа
        • Анналы инфекций и антибиотиков Журнал открытого доступа
        • Архивы исследований рака Журнал открытого доступа
        • Архивы медицины Журнал открытого доступа
        • Archivos de Medicina Журнал открытого доступа
        • Рак груди: текущие исследования Журнал открытого доступа
        • Британский биомедицинский бюллетень Журнал открытого доступа
        • Отчет о слушаниях в Канаде Журнал открытого доступа
        • Химиотерапия: открытый доступ Официальный журнал Итало-латиноамериканского общества этномедицины
        • Хроническая обструктивная болезнь легких: открытый доступ Журнал открытого доступа
        • Отчеты о клинических и медицинских случаях
        • Журнал клинической гастроэнтерологии Журнал открытого доступа
        • Клиническая детская дерматология Журнал открытого доступа
        • Колоректальный рак: открытый доступ Журнал открытого доступа
        • Косметология и хирургия лица Журнал открытого доступа
        • Акушерство и гинекология интенсивной терапии Журнал открытого доступа
        • Текущие исследования: интегративная медицина Журнал открытого доступа
        • Стоматологическое здоровье: текущие исследования Гибридный журнал открытого доступа
        • Стоматология Журнал открытого доступа, Официальный журнал Александрийской ассоциации оральной имплантологии, Лондонская школа лицевой ортотропии
        • Дерматология и дерматологические заболевания Журнал открытого доступа
        • Отчеты о случаях дерматологии Журнал открытого доступа
        • Диагностическая патология: открытый доступ Журнал открытого доступа
        • Неотложная медицина: открытый доступ Официальный журнал Всемирной федерации обществ педиатрической интенсивной и интенсивной терапии
        • Эндокринология и диабетические исследования Гибридный журнал открытого доступа
        • Эндокринология и метаболический синдром Официальный журнал Ассоциации осведомленности о СПКЯ
        • Эндокринологические исследования и метаболизм
        • Эпидемиология: открытый доступ Журнал открытого доступа
        • Доказательная медицина и практика Журнал открытого доступа
        • Семейная медицина и медицинские исследования Журнал открытого доступа
        • Лечебное дело: открытый доступ Журнал открытого доступа
        • Гинекология и акушерство Журнал открытого доступа, Официальный журнал Ассоциации осведомленности о СПКЯ
        • Отчет о гинекологии и акушерстве Журнал открытого доступа
        • Лечение волос и трансплантация Журнал открытого доступа
        • Исследования рака головы и шеи Журнал открытого доступа
        • Гепатология и панкреатология
        • Фитотерапия: открытый доступ Журнал открытого доступа
        • Анализ артериального давления Журнал открытого доступа
        • Информация о заболеваниях грудной клетки Журнал открытого доступа
        • Информация о гинекологической онкологии Журнал открытого доступа
        • Внутренняя медицина: открытый доступ Журнал открытого доступа
        • Международный журнал болезней органов пищеварения Журнал открытого доступа
        • Международный журнал микроскопии
        • Международный журнал физической медицины и реабилитации Журнал открытого доступа
        • JOP.Журнал поджелудочной железы Журнал открытого доступа
        • Журнал аденокарциномы Журнал открытого доступа
        • Журнал эстетической и реконструктивной хирургии Журнал открытого доступа
        • Журнал артрита Журнал открытого доступа
        • Журнал спортивного развития Гибридный журнал открытого доступа
        • Журнал автакоидов и гормонов
        • Журнал крови и лимфы Журнал открытого доступа
        • Журнал болезней крови и переливания Журнал открытого доступа, Официальный журнал Международной федерации талассемии
        • Журнал исследований крови и гематологических заболеваний Журнал открытого доступа
        • Журнал отчетов и рекомендаций по костям Журнал открытого доступа
        • Журнал костных исследований Журнал открытого доступа
        • Журнал исследований мозга
        • Журнал клинических испытаний рака Журнал открытого доступа
        • Журнал диагностики рака Журнал открытого доступа
        • Журнал исследований рака и иммуноонкологии Журнал открытого доступа
        • Журнал онкологической науки и исследований Журнал открытого доступа
        • Журнал канцерогенеза и мутагенеза Журнал открытого доступа
        • Журнал кардиологической и легочной реабилитации
        • Журнал клеточной науки и апоптоза
        • Журнал детства и нарушений развития Журнал открытого доступа
        • Журнал детского ожирения Журнал открытого доступа
        • Журнал клинических и медицинских тематических исследований
        • Журнал клинической и молекулярной эндокринологии Журнал открытого доступа
        • Журнал клинической анестезиологии: открытый доступ
        • Журнал клинической иммунологии и аллергии Журнал открытого доступа
        • Журнал клинической микробиологии и противомикробных препаратов
        • Журнал клинических респираторных заболеваний и ухода Журнал открытого доступа
        • Журнал коммуникативных расстройств, глухих исследований и слуховых аппаратов Журнал открытого доступа
        • Журнал врожденных заболеваний
        • Журнал контрацептивных исследований Журнал открытого доступа
        • Журнал стоматологической патологии и медицины
        • Журнал диабета и метаболизма Официальный журнал Европейской ассоциации тематической сети по биотехнологиям
        • Журнал диабетических осложнений и медицины Журнал открытого доступа
        • Журнал экологии и токсикологии Журнал открытого доступа
        • Журнал судебной медицины Журнал открытого доступа
        • Журнал желудочно-кишечной и пищеварительной системы Журнал открытого доступа
        • Журнал рака желудочно-кишечного тракта и стромальных опухолей Журнал открытого доступа
        • Журнал генитальной системы и заболеваний Гибридный журнал открытого доступа
        • Журнал геронтологии и гериатрических исследований Журнал открытого доступа
        • Журнал токсичности и болезней тяжелых металлов Журнал открытого доступа
        • Журнал гематологии и тромбоэмболических заболеваний Журнал открытого доступа
        • Журнал гепатита Журнал открытого доступа
        • Журнал гепатологии и желудочно-кишечных расстройств Журнал открытого доступа
        • Журнал HPV и рака шейки матки Журнал открытого доступа
        • Журнал гипертонии: открытый доступ Журнал открытого доступа, Официальный журнал Словацкой лиги против гипертонии
        • Журнал визуализации и интервенционной радиологии Журнал открытого доступа
        • Журнал интегративной онкологии Журнал открытого доступа
        • Журнал почек Журнал открытого доступа
        • Журнал лейкемии Журнал открытого доступа
        • Журнал печени Журнал открытого доступа
        • Журнал печени: болезни и трансплантация Гибридный журнал открытого доступа
        • Журнал медицинской и хирургической патологии Журнал открытого доступа
        • Журнал медицинских диагностических методов Журнал открытого доступа
        • Журнал медицинских имплантатов и хирургии Журнал открытого доступа
        • Журнал медицинской физики и прикладных наук Журнал открытого доступа
        • Журнал медицинской физиологии и терапии
        • Журнал медицинских исследований и санитарного просвещения
        • Журнал медицинской токсикологии и клинической судебной медицины Журнал открытого доступа
        • Журнал метаболического синдрома Журнал открытого доступа
        • Журнал микробиологии и патологии
        • Журнал молекулярной гистологии и медицинской физиологии Журнал открытого доступа
        • Журнал молекулярной патологии и биохимии
        • Журнал морфологии и анатомии
        • Журнал молекулярно-патологической эпидемиологии MPE Журнал открытого доступа
        • Журнал неонатальной биологии Журнал открытого доступа
        • Журнал новообразований Журнал открытого доступа
        • Журнал нефрологии и почечных заболеваний Журнал открытого доступа
        • Журнал нефрологии и терапии Журнал открытого доступа
        • Журнал исследований нейроэндокринологии
        • Журнал новых физиотерапевтических методов Журнал открытого доступа
        • Журнал расстройств питания и терапии Журнал открытого доступа
        • Журнал ожирения и расстройств пищевого поведения Журнал открытого доступа
        • Журнал ожирения и терапии Журнал открытого доступа
        • Журнал терапии ожирения и похудания Журнал открытого доступа
        • Журнал ожирения и метаболизма
        • Журнал одонтологии
        • Журнал онкологической медицины и практики Журнал открытого доступа
        • Журнал онкологических исследований и лечения Журнал открытого доступа
        • Журнал онкологических трансляционных исследований Журнал открытого доступа
        • Журнал гигиены полости рта и здоровья Журнал открытого доступа, Официальный журнал Александрийской ассоциации оральной имплантологии, Лондонская школа лицевой ортотропии
        • Журнал ортодонтии и эндодонтии Журнал открытого доступа
        • Журнал ортопедической онкологии Журнал открытого доступа
        • Журнал остеоартрита Журнал открытого доступа
        • Журнал остеопороза и физической активности Журнал открытого доступа
        • Журнал отологии и ринологии Гибридный журнал открытого доступа
        • Журнал детской медицины и хирургии
        • Журнал по лечению боли и медицине Журнал открытого доступа
        • Журнал паллиативной помощи и медицины Журнал открытого доступа
        • Журнал периоперационной медицины
        • Журнал физиотерапии и физической реабилитации Журнал открытого доступа
        • Журнал исследований и лечения гипофиза
        • Журнал беременности и здоровья ребенка Журнал открытого доступа
        • Журнал профилактической медицины Журнал открытого доступа
        • Журнал рака простаты Журнал открытого доступа
        • Журнал легочной медицины Журнал открытого доступа
        • Журнал пульмонологии и респираторных заболеваний
        • Журнал редких заболеваний: диагностика и терапия
        • Журнал регенеративной медицины Гибридный журнал открытого доступа
        • Журнал репродуктивной биомедицины
        • Журнал сексуальной и репродуктивной медицины подписка
        • Журнал спортивной медицины и допинговых исследований Журнал открытого доступа
        • Журнал стероидов и гормонологии Журнал открытого доступа
        • Журнал хирургии и неотложной медицины Журнал открытого доступа
        • Журнал хирургии Jurnalul de Chirurgie Журнал открытого доступа
        • Журнал тромбоза и кровообращения: открытый доступ Журнал открытого доступа
        • Журнал заболеваний щитовидной железы и терапии Журнал открытого доступа
        • Журнал традиционной медицины и клинической натуропатии Журнал открытого доступа
        • Журнал травм и лечения Журнал открытого доступа
        • Журнал исследований опухолей Журнал открытого доступа
        • Журнал исследований и отчетов по опухолям Журнал открытого доступа
        • Журнал сосудистой и эндоваскулярной терапии Журнал открытого доступа
        • Журнал сосудистой медицины и хирургии Журнал открытого доступа
        • Журнал женского здоровья, проблем и ухода Гибридный журнал открытого доступа
        • Журнал йоги и физиотерапии Журнал открытого доступа, Официальный журнал Федерации йоги России и Гонконгской ассоциации йоги
        • La Prensa Medica
        • Контроль и ликвидация малярии Журнал открытого доступа
        • Материнское и детское питание Журнал открытого доступа
        • Медицинские и клинические обзоры Журнал открытого доступа
        • Медицинская и хирургическая урология Журнал открытого доступа
        • Отчеты о медицинских случаях Журнал открытого доступа
        • Медицинские отчеты и примеры из практики открытый доступ
        • Нейроонкология: открытый доступ Журнал открытого доступа
        • Медицина труда и здоровье Журнал открытого доступа
        • Радиологический журнал OMICS Журнал открытого доступа
        • Отчеты о онкологии и раковых заболеваниях Журнал открытого доступа
        • Здоровье полости рта и лечение зубов Журнал открытого доступа Официальный журнал Лондонской школы лицевой ортотропии
        • Отчеты о заболеваниях полости рта Журнал открытого доступа
        • Ортопедическая и мышечная система: текущие исследования Журнал открытого доступа
        • Отоларингология: открытый доступ Журнал открытого доступа
        • Заболевания поджелудочной железы и терапия Журнал открытого доступа
        • Педиатрическая помощь Журнал открытого доступа
        • Скорая педиатрическая помощь и медицина: открытый доступ Журнал открытого доступа
        • Педиатрия и медицинские исследования
        • Педиатрия и терапия Журнал открытого доступа
        • Пародонтология и протезирование Журнал открытого доступа
        • Психология и психиатрия: открытый доступ
        • Реконструктивная хирургия и анапластология Журнал открытого доступа
        • Отчеты в журнале “Рак и лечение”
        • Отчеты в маркерах заболеваний
        • Отчеты в исследованиях щитовидной железы
        • Репродуктивная система и сексуальные расстройства: текущие исследования Журнал открытого доступа
        • Исследования и обзоры: Journal of Dental Sciences Журнал открытого доступа
        • Исследования и обзоры: медицинская и клиническая онкология
        • Исследования и отчеты в гастроэнтерологии Журнал открытого доступа
        • seo sorgula Журнал открытого доступа
        • Кожные заболевания и уход за кожей Журнал открытого доступа
        • Хирургия: Текущие исследования Официальный журнал Европейского общества эстетической хирургии
        • Трансляционная медицина Журнал открытого доступа
        • Травмы и неотложная помощь Журнал открытого доступа
        • Тропическая медицина и хирургия Журнал открытого доступа
        • Универсальная хирургия Журнал открытого доступа
        • Всемирный журнал фармакологии и токсикологии
.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *